Toll样受体与内毒素的作用

大量动物实验和临床资料表明,肠源性内毒素血症在肝炎重症化和慢性化中发挥重要作用.关于Gram阴性细菌内毒素(endotoxin)即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是通过何种途径发挥其毒性作用这一问题,多年来一直是研究者们关注的重要课题.理论上讲, 宿主对LPS的识别和信号转导是革兰氏阴性细菌致病及对其防治的关键.Ulevitch实验室[1]在1986年发现并克隆了血清因子脂多糖结合蛋白LBP(LPS binding protein), 1990年又发现并认为CD14是LPS的受体,并在此基础上提出了LPS介导细胞反应的模式:即LBP穿梭样运动把LPS转运到髓样细胞的膜上,与膜CD14(mCD14)结合形成复合物,将信号转导到细胞内 .这些发现对人们认识LPS介导的细胞反应起到重要的里程碑作用.但由于CD14与多种传递信号的跨膜受体不同,是没有跨膜区和胞浆内段的锚定蛋白,不能直接和细胞内进行信息交流.因而信号通过该途径传导的机制未能令人信服.随着对Toll样受体(Toll-like recept ors,TLRs)研究的深入,使人们对LPS信号转导通路的认识有了长足的进步.     

Toll样受体介导的信号转导通路及其与炎症和肿瘤的关系

以往研究表明,多种病原微生物的细胞壁成分如革兰氏阴性杆菌的内毒素脂多糖（LPS）、革兰氏阳性菌的肤聚糖（PCN）和脂磷壁酸（LTA）等,具有强大的抗原刺激能力,均可通过与细胞表面的蛋白质受体CD14结合,促进单核／巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等活化,并释放大量炎症介质。然而,由于CD14本身是一种缺乏跨膜区和胞内区的膜锚蛋白,不能直接介导跨膜信号转导,那么究竟是什么起着跨膜信号转导作用将信号传到细胞内？     

内毒素诱导的TLR4信号转导通路研究进展

TLR4是内毒素(LPS)激活信号转导的受体。LPS首先与LPS结合蛋白(LBP)结合，再传递给CD14分子，形成LPS-LBP-CD14复合物，该复合物与TLR4-MD2相互作用，通过激活细胞内的信号通路而最终导致核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)等核转录因子的活化，从而诱导炎症细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、NO等的大量表达引发脓毒症。对TLR4的研究使我们可以从阻断TLR4信号通路中发挥毒性作用的环节来预防和治疗脓毒性休克。     

支架蛋白JLP对树突状细胞CD40分子跨膜穿梭转运的调控作用

目的:了解支架蛋白JLP分子在树突状细胞(DC)中的表达及其在CD40分子跨膜穿梭转运中的作用。方法:以GM-CSF诱导骨髓干细胞分化为骨髓来源的DC(BMDC)。给予BMDC不同刺激和处理后,通过Western blot检测BMDC中JLP的表达情况。采取慢病毒介导的shRNA干扰技术抑制BMDC中JLP表达,给予BMDC不同刺激或处理后,通过流式细胞技术检测细胞表面及细胞总CD40分子表达水平变化。通过胞内因子染色技术检测不同处理后细胞内IL-12分子的表达。结果:幼稚BMDC表达低水平JLP,Poly I∶C刺激可上调未成熟BMDC表达JLP,但细菌脂多糖(LPS)刺激则不能上调JLP表达。LPS诱导成熟后的BMDC进一步给予抗CD40抗体刺激则可诱导JLP表达。CD40与配体结合导致LPS活化的DC表面CD40分子表达水平明显下调,但细胞总CD40表达水平无变化。在JLP基因敲除的情况下,LPS处理的DC表面CD40分子表达明显减少,但细胞总CD40分子表达水平无变化。CD40抗体或CD40L处理成熟DC后可介导CD40分子内化,在JLP缺失情况下CD40分子内化明显减低。结论:支架蛋白JLP分子参与了BMDC中CD40分子的跨膜穿梭转运。     

维生素D3诱导U937细胞表达CD14蛋白的方法

目的探讨维生素D3诱导的U937细胞CD14蛋白表达的方法及其对内毒素刺激的反应性。方法用(0．1μMol)VitD3与U937细胞共同培养24h以诱导其表达CD14基因，使其产生CD14蛋白，并观察U937细胞对不同浓度LPS刺激不同时间后的反应。结果发现VitD3能稳定诱导U937细胞表达CD14mRNA基因和CD14蛋白，转型的U937／CD14细胞显著增加了对LPS刺激的敏感性，表现为低浓度LPS刺激能诱导其细胞核中NF-κ3B激活，指导TNF-a的mRNA的转录和表达，进一步合成和释放TNF-a。结论U937细胞是研究CD14在LPS介导MO激活的理想细胞模型，维生素D3能诱导U937细胞CD14基因和蛋白的表达，并增加其对内毒素刺激的反应性。     

烧伤血清对离体大鼠肺泡巨噬细胞CD14表达变化的影响

目的 :探讨烧伤血清对离体大鼠肺泡巨噬细胞 (AM )CD14的mRNA基因和膜蛋白 (mCD14 )表达变化及其对AM分泌细胞因子的影响。　方法 :分离并收集大鼠AM ,以烧伤血清及LPS刺激 ,再分别以抗CD14抗体作用后提取总RNA ,用RT PCR方法检测不同时相点CD14mRNA表达 ;用ELISA方法检测培养液中TNF α和IL 6浓度 ;免疫组化法检测AM膜CD14蛋白表达变化。　结果 :经烧伤血清和LPS刺激后 ,AM的CD14基因以及蛋白表达从 1h起就开始增加 ,2h达峰值 ,然后逐渐减弱。上述改变在伤后 12h内持续 ,细胞因子分泌相应增加 ;抗CD14抗体阻断CD14作用后 ,CD14的基因和蛋白表达显著降低 ,细胞因子分泌亦相应减少。　结论 :严重烧伤后可能随着LPS增加 ,通过激活内毒素信号传导通路 ,使AM分泌细胞因子增加。这种作用可以被抗CD14抗体所阻断 ,提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少细胞因子的合成和分泌     

内毒素对巨噬细胞膜CD14表达的影响及与膜脂微环境关系

目的 研究内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激下巨噬细胞膜脂改变对CD14表达的影响。方法 LPS体外刺激巨噬细胞，用Western blot及RT-PCR检测随时问变化细胞膜CD14 mRNA及蛋白表达的变化；同时观察膜脂微环境变化对CD14表达的影响。结果 LPS刺激巨噬细胞1h CD14表达增加，5h达高峰，8h降至正常水平；而CD14 mRNA水平3h达高峰，5h降低。LPS刺激巨噬细胞5h后细胞膜脂成分降解，膜脂流动性降低，CD14表达增加；用脂质体预处理后膜脂含量增加，膜脂流动性增加，CD14表达降低。结论 LPS体外刺激能上调巨噬细胞膜CD14表达，且此调节作用可能至少发生在转录水平；LPS刺激巨噬细胞使主要膜脂成分降解，膜流动性降低，这可能是LPS上调CD14的重要原因。     

和厚朴酚抑制内毒素诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子表达的研究

目的：观察和厚朴酚（HNK）对内毒素（LPS）诱导人肾小球系膜细胞（HRMCs）炎症反应的抑制作用及其分子机制研究。方法：以MTS法检测和厚朴酚（0～160μmol/L）对人肾小球系膜细胞的毒性作用,确定合适的药物实验浓度。将系膜细胞与LPS（1μg/ml）及不同浓度的和厚朴酚（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,并提取细胞蛋白。ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的表达水平,免疫印迹Western blot法检测细胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α磷酸化、非磷酸化蛋白表达水平,探讨和厚朴酚的抗炎作用机制。结果：20μmol/L及以下的和厚朴酚浓度对系膜细胞无明显毒性作用,但40μmol/L及以上的浓度明显降低系膜细胞的增殖活力。LPS刺激可显著诱导系膜细胞炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-18及TGF-β1的产生。和厚朴酚（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症因子的表达。免疫印迹结果显示,和厚朴酚可显著抑制LPS诱导的系膜细胞NF-κB p65,IKK-α/β及IKB-α等信号分子蛋白磷酸化水平。结论：和厚朴酚能有效抑制LPS诱导的人肾小球系膜细胞炎性细胞因子的表达,其机制部分通过抑制细胞NF-κB p65、IKK-α/β及IKB-α等信号分子的磷酸化水平。     

LPLUNC1对上呼吸道抗感染防御机制的影响

目的:拟以LPLUNC1作为上呼吸道抗感染的候选分子,探讨其在宿主细胞内抗感染防御的作用机制.方法:应用GST蛋白纯化法获取LPLUNC1融合蛋白,并采用微量肉汤稀释法测定LPLUNC1蛋白对革兰阴性菌绿脓杆菌细菌集落形成的影响；通过体外脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)结合实验、细胞凋亡测定法探讨LPLUNC1体外结合绿脓杆菌LPS成分的能力和诱导靶细胞发生细胞凋亡的程度,并通过ELISA、Western blot印记实验分析了解LPLUNC1-LPS的结合对小鼠RAW 264.7靶细胞膜CD14受体以及胞内细胞因子TNF-α表达的影响.结果:LPLUNC1没有明显的直接抑制革兰阴性菌的特性,也不具备明显的直接杀伤革兰阴性菌的功能,但它可与革兰阴性菌LPS成分特异结合,对LPS有高度敏感性.LPLUNC1与LPS结合后可抑制CD14受体和TNF-α的表达.结论:LPLUNC1通过高度结合革兰阴性菌LPS成分,阻抑CD14介导的信号转导途径,抑制细胞内TNF-α等细胞因子的表达,引发宿主上呼吸道抗感染防御.     

脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的人单核巨噬细胞株表达CD14的影响

目的研究脂多糖结合蛋白(LBP)抑制肽对内毒素(LPS)诱导的人单核巨噬细胞株U937细胞表达CD14的影响。方法佛波脂(PMA)诱导U937成熟后分为5组:正常对照组、LPS组(100ng/mLLPS 100ng/mLrhLBP)、低剂量抑制肽组、中剂量抑制肽组及高剂量抑制肽组,后3组分别给予10、100和1000ng/mL抑制肽。用RTPCR和蛋白定量方法(Westernblot)测定CD14mRNA和蛋白的表达,ELISA测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量。结果LBP抑制肽显著抑制LPS刺激后U937细胞CD14的mRNA与蛋白表达,同时也抑制了TNFα的分泌,较LPS组有显著差异。结论LBP抑制肽通过抑制由CD14介导的LPS信号跨膜转导和TNFα的分泌,对LPS所致疾病如脓毒血症、急性肺损伤可能有潜在的治疗作用。