oleosin-rhFGF9融合蛋白的红花表达及其毛发再生、创伤修复研究北大核心CSCD

利用红花表达成纤维细胞生长因子9（fibroblast growth factor 9,FGF9）重组融合蛋白,研究其对毛发生长及创伤修复的作用,为红花作为植物反应器提供基础并对FGF9融合蛋白毛发及创伤商业化应用奠定基础。通过冻融法将鉴定的p OTBar-oleosin-rhFGF9质粒转入农杆菌EHA105中,农杆菌介导法将oleosin-rhFGF9基因转入红花子叶中,经红花组织培养、Basta筛选获得转基因再生苗,嫁接法,PCR试验验证,扩繁,获得转基因T3红花种子。Western blot法分析及ELISA定量融合蛋白含量为0.09%。在质量浓度为60μg·L-1时,转基因红花油体促NIH/3T3细胞增殖较好,且有一定剂量依赖性。C57BL/6小鼠60只,分别建立脱发模型和创伤模型,分别为空白组（PBS或生理盐水）、阴性组（野生型红花种子油体,60 g·L-1）、阳性组（FGF9,0.054 g·L-1）、低剂量组（转基因红花油体,10 g·L-1）和高剂量组（转基因红花油体,60 g·L-1）,隔天涂抹1次,每次100μL,15 d后取皮,固定包埋进行组织学分析。小鼠毛发实验结果表明各组小鼠毛发长势良好,其中高剂量组小鼠毛发浓密,再生毛发数均较阳性组有显著效果;创伤实验愈合明显,阳性组、高剂量组、低剂量组愈合效果较空白组均显著,且在第5天,高剂量组愈合效果显著优于阳性组。该实验成功转化红花,获得了oleosin-rhFGF9融合蛋白表达的T3转基因红花,其具有促进毛发再生和创伤修复的作用。     

利用红花瞬时表达aFGF-GFP融合基因的研究

目的:利用红花表达aFGF可以使aFGF的组织创伤修复的活性和红花的活血通经、散瘀止痛以及跌打损伤等功效累加,直接用于外伤修复.方法:利用分子生物学方法构建aFGF与GFP的融合基因载体,通过农杆菌介导法将其转化到红花中,形成抗性红花愈伤组织后,利用荧光显微镜进行检测.结果:通过PCR分别扩增了aFGF和GFP基因片段,确定出PCR反应体系和最佳反应条件,合成了融合基因片段aFGF-CFP,成功构建了植物荧光表达载体pCAMB认1390::35S::aFGF-GFP,用其转化红花,获得的抗性愈伤组织在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光.结论:抗性红花愈伤组织中的GFP表达效果良好,初步判断aFCF基因在植物细胞中也已经表达.     

101－B毛发再生精的皮肤毛发药理作用研究

本实验研究了１０１－Ｂ毛发再生精的皮肤毛发药理作用。结果表明，１０１－Ｂ毛发再生精连续用药１０－１８天对正常大鼠，豚鼠家兔有促进体毛生长作用，并能预防灌服碳酸铊所致大鼠毛脱落。对组织胺和木瓜酶诱发豚鼠痒反应有止痒作用，对正常及内毒素所致微循环障碍小鼠的耳廓微循环有改善作用。对阿霉素引起的大鼠皮肤溃疡有保护作用。这些作用机理的阐明为其临床应用提供了依据。     

101－B毛发再生精的皮肤毛发药理作用研究

本实验研究了１０１－Ｂ毛发再生精的皮肤毛发药理作用。结果表明，１０１－Ｂ毛发再生精连续用药１０～１８天对正常大鼠、豚鼠和家兔有促进体毛生长作用，并能预防灌服碳酸铊所致大鼠体毛脱落。对组织胺和木瓜酶诱发豚鼠痒反应有止痒作用。对正常及内毒素所致微循环障碍小鼠的耳廓微循环有改善作用。对阿霉素引起的大鼠皮肤溃疡有保护作用。这些作用机理的阐明为其临床应用提供了依据。     

广地龙纯化蛋白促进创伤修复作用机制研究

目的：研究广地龙纯化蛋白促进创伤修复的作用机制。方法：采用细胞计数试剂（CCK-8）法，检测给药后对人永生化角质形成细胞（HaCaT）和小鼠成纤维细胞（NIH3T3）增殖的影响；通过划痕实验，检测HaCaT细胞和NIH3T3细胞迁移的影响；利用羟脯氨酸检测试剂盒和酶联免疫吸附试验法，检测NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ和基质金属蛋白酶-1水平。结果：在一定范围内，地龙蛋白能促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移，分别在0.313 mg/mL和1.250 mg/mL时，细胞增殖活性最强，划痕愈合率最高；给药后NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ水平明显升高，基质金属蛋白酶-1水平显著降低，在1.250 mg/mL时，与对照组比较最显著。结论：广地龙纯化蛋白组分通过促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移，促进NIH3T3细胞胶原蛋白合成与分泌，抑制胶原蛋白降解，从而促进创伤修复。     

红花多糖对荷瘤鼠Ang-2、PTEN蛋白表达的影响

目的:研究红花多糖(SPS)对荷瘤鼠的移植瘤组织中Ang-2、PTEN蛋白表达的影响及意义。方法:选择昆明种小鼠80只制备荷瘤小鼠,随机分为4组,每组20只。对照组:模型组;实验组:环磷酰胺药物组、红花多糖+环磷酰胺药物联合组、受试药物红花多糖组。用药方法:(1)模型对照组给荷瘤鼠灌服生理盐水;(2)环磷酰胺药物组灌服环磷酰胺;(3)红花多糖+环磷酰胺药物联合组灌服环磷酰胺和红花多糖;(4)红花多糖组:红花多糖灌服荷瘤鼠。给药10天后停药,取肿瘤组织,称取湿重,计算抑瘤率。然后用S-P免疫组织化学法测定对照组、实验组荷瘤鼠移植瘤组织中Ang-2、PTEN蛋白的表达情况。结果:荷瘤鼠灌服生理盐水的模型对照组移植瘤组织中Ang-2的免疫组化阳性表达率显著高于各实验组(P0.05),而PTEN蛋白的阳性表达率显著低于各实验组(P0.01)。红花多糖、环磷酰胺联合用药组的抑瘤率最高,其次为环磷酰组、红花多糖组。结论:红花多糖具有抑制肿瘤组织生长的作用,可降低肿瘤组织中Ang-2的表达,从而增强PTEN蛋白的表达。     

金属硫蛋白2基因在红花中表达的初步研究

目的 获得转金属硫蛋白2(metallothionein 2,MT2)红花植株,为MT药用蛋白的生产奠定基础。方法采用Nco I/HindⅢ酶切pEASY-oleosin-MT获得oleosin-MT融合基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOP-oleosin-MT转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转MT基因红花植株进行PCR检测及Southern blotting检测。结果成功构建了MT基因的植物油体表达载体pOP-oleosin-MT,获得了3株PCR检测呈阳性的转MT基因红花植株。结论建立了完善的红花再生体系,获得了转MT基因的红花植株。     

积雪草苷-海藻酸钠修复贴的制备及其创伤修复作用研究

目的制备积雪草苷-海藻酸钠修复贴(As-SA RP)并评价其对皮肤创伤修复的效果。方法利用海藻酸钠与Ca2+交联成膜的特点,以积雪草苷为药物模型,通过与海藻酸钠共混的方式成功制备了As-SARP,采用扫描电子显微镜及红外光谱考察共混膜的相容性,并用新西兰大耳兔背部脊柱两侧的全层皮肤建立创伤模型,通过观察各组家兔受损皮肤的愈合状况并测定其受损皮肤组织中胶原(羟脯氨酸作为指标)和促炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表达水平以考察外敷As-SA RP对皮肤创面的修复效果。结果积雪草苷与海藻酸钠具有良好的相容性,可成功制备As-SA RP修复贴。相较于其他组,As-SA RP处理后皮肤受损处的红肿、出血、感染、渗出液情况明显减少,创面愈合率也相对升高。病理结构显示As-SA RP组家兔皮肤中炎性细胞浸润较少、新生的毛细血管较多、创面皮肤结构较完整且胶原纤维排列相对紧密有序。同时,生化分析结果显示As-SA RP能有效抑制受损皮肤组织中促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的高表达,并可明显增高其中羟脯氨酸及胶原纤维含量。结论 As-SARP可在一定程度上提升皮肤对积雪草苷的吸收...     

红花注射液促进缺血性脑卒中内源性修复的作用及其机制研究

目的探讨红花注射液促进缺血性脑卒中内源性修复的作用及其机制。方法采用线栓法制备pMCAO模型,在缺血后24h,红花注射液各剂量组给予腹腔注射红花注射液,维脑路通组同时给予相应的维脑路通注射液治疗,每天1次,连续14d。于术后1、3、7、14天分别对各组大鼠进行Bederson神经功能评分、肌力评定;14d后抽血检测炎症因子白介素-6、C反应蛋白;通过Western blot检测SDF-1蛋白的表达。结果造模各组在术后第1天,Bederson评分均高于假手术组,有显著性差异(P0.001)、肌力评分均低于假手术组,有显著差异(P0.001),且随着时间的延长,红花中剂量的效果越明显。与正常组、假手术组比较,模型组IL-6、CRP显著升高,差异有统计学意义(P0.001);较模型组,维脑路通组、红花中剂量组亦有显著差异(P0.001)。SDF-1蛋白表达,与正常组、假手术组相比,模型组、维脑路通组、红花中剂量组的表达有显著性差异(P0.001);较模型组,维脑路通组、红花中剂量组亦有很大的差异性(P0.001);相比维脑路通组,红花中剂量组SDF-1的表达亦有统计学意义(P0.05)。结论红花注射液可促进缺血性脑卒中内源性修复,其机制研究可能是通过提高缺血梗死部位趋化因子SDF-1的表达实现的。     

大豆24 kDa油体蛋白基因与aFGF融合转化红花的研究

目的: 利用红花表达酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF),为利用植物生物反应器规模化生产aFGF奠定基础. 方法: 将人源aFGF基因改造为植物偏好性的aFGF基因序列,通过PCR搭桥技术克隆植物偏好的aFGF基因,利用酶切连接方法构建植物油体表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌EHA105,利用农杆菌介导的方法转化到塔城红花中,对转化红花进行PCR,Southern杂交,RT-PCR分子检测. 结果: 扩增出植物偏好的aFGF基因的全长序列,并与大豆油体蛋白基因Doil基因融合,成功地插入到改造好的含有大豆油体蛋白启动子表达载体中, 探索了进行红花遗传转化的最佳条件,成功获得单位点插入的3个独立转化红花植株,在转录水平都有大小一致的aFGF的表达. 结论: 该实验成功构建了含aFGF植物油体表达载体,并筛选出最佳的遗传转化条件,A为0.6,侵染时间为10 min,共培养3 d,获得了aFGF转录水平表达的转基因红花植株,这将红花油体蛋白本身的皮肤保护作用,与FGFs的创伤修复作用累加,快速开发出外用创伤药物奠定基础.     

BAP-SRC-1融合蛋白的表达及其在药物代谢酶调控研究中的应用

 目的获得活性表达的细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)基因和人甾体受体辅活化因子-1(steroid recep- tor coactivator-1,SRC-1)的融合蛋白,应用于辅活化因子与核受体的结合研究。方法从Escherichia coli JM83基因组和人肝总RNA中分别扩增获得BAP基因和SRC-1的186个氨基酸对应的基因序列(简称SRC186)。用重组技术,构建BAP-SRC186- pET28a融合基因表达载体,在Escherichia coli Rosetta(DE3)中,以IPTG低温诱导表达。以对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl-phos- phate,PNPP)为底物进行活性测定。活性表达的BAP-SRC186融合蛋白被应用于辅活化因子与核受体的结合研究。结果获得可溶性融合蛋白BAP-SRC186。该融合蛋白的BAP比活为(0.176±0.013 4)μmol·min^-1·mg(pro)^-1 在利福平存在的情况下,BAP-SRC186能与孕烷X受体配体结合域(pregnane X receptor ligand binding domain,PXRLBD)发生利福平剂量依赖性的相互作用,作用强度通过BAP的显色反应可方便地检测结论BAP融合蛋白与核受体的结合研究为药物代谢酶调控的体外研究开辟了新的思路。     

羟基红花黄色素A对人胃癌移植瘤裸鼠瘤组织bFGF蛋白及MMP-9表达的影响

目的:研究羟基红花黄色素A(hydroxy safflor yellow A,HSYA)对人胃癌裸鼠皮下移植瘤碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)蛋白以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA及蛋白表达的影响。方法:采用BALB/C nu/nu裸小鼠接种人胃腺癌细胞株BGC-823右前肢腋部皮下建立裸鼠人癌移植瘤模型,随机分为模型组、阳性对照环磷酰胺组(2 g.L-1)、HSYA组(0.056,0.028 g.L-1),观察抑瘤作用,并采用实时荧光定量PCR(real time-fluorescent quantitation PCR,RTFQ-PCR)检测瘤组织中MMP-9 mRNA表达;酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检测瘤组织中bFGF,MMP-9蛋白表达。结果:HSYA0.028 g.L-1组抑瘤效果明显,且其MMP-9 mRNA表达及bFGF与MMP-9蛋白表达与模型组比,均明显降低(P0.05)。结论:一定浓度的HSYA抑制肿瘤生长的机制之一可能与抑制bFGF,MMP-9的表达,减少瘤组织血管基底膜的降解,阻抑血管移行以减少血管生成有关。     

红花妊娠毒性选择性表达的实验研究

目的:通过研究红花的毒性作用对不同机能状态下的妊娠大鼠的选择性,探讨中药的毒性作用在机体不同机能状态下具有特异的选择性。方法:用含生药2g/kg的红花煎剂分别给正常妊娠大鼠(红花组)和外伤血瘀妊娠大鼠(红花治疗组)灌胃,观察红花煎液分别对两组大鼠妊娠和胚胎发育的影响。结果:与空白组比较,红花组生产数明显减少(P<0.001),妊娠时间延长(P<0.05),完全流产率高达25%,胚胎未成形率为35%,母体体重增长缓慢(P<0.05),肝重指数及肾重指数均有所增高,胚胎宫内生长迟缓率(IUGR)高达100%;而红花治疗组在妊娠和胎儿的各项指标上均接近于空白组。结论:红花仅对正常孕鼠表现为毒性作用,说明红花的妊娠毒性在机体处于不同机能状态下具有选择性。     

七叶皂苷钠对脑缺血大鼠MMP-9mRNA及其蛋白表达的影响

目的：观察七叶皂苷钠对脑缺血大鼠MMP-9mRNA及其蛋白表迭的影响。方法：采用Longa线栓法制作鼠动脉检塞模型,免疫组化和原住杂交测定不同时间点鼠缺血脑组织MMP-9及其mRNA的表达。结果：模型组鼠脑中MMP-9厦mRNA表达增强。与模型组相比,小剂量治疗后脑MMP-9及mRNA表达略有下降,大剂量治疗组下降更为明显,组问比较有统计学意义（P〈0．05）。结论：鼠脑动脉栓塞后MMP-9表达增加,呈一定时相性;七叶皂苷钠治疗后可能通过减少MMP-9的表迭,抑制脑水肿的形成,具有对抗脑损伤的作用。     

小柴胡汤加减对青春期痤疮的临床疗效及其对MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白表达的影响

目的:观察小柴胡汤加减对青春期痤疮的临床疗效及其对血清炎性反应因子、内分泌功能、免疫功能及基质金属蛋白酶水平的影响。方法:选取2016年8月至2018年3月江苏省中医院收治的青春期痤疮患者126例,按照随机数字表法随机分为对照组和观察组,每组63例。对照组给予米诺环素联合过氧化苯甲酰软膏外抹,观察组在对照组治疗的基础上给予小柴胡汤,观察2组血清炎性反应因子(IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ)、激素水平(DHT、FT、SHBG)、免疫功能(Ig G、Ig M、Ig A、补体C3、补体C4)及基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9)变化情况。结果:观察组治疗后DHT、FT水平明显低于对照组治疗后水平(P 0. 05),SHBG明显高于对照组治疗后水平(P 0. 05)。与治疗前比较,2组治疗后IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ、Ig G、Ig M、Ig A、补体C3、补体C4、MMP-1、MMP-3、MMP-9水平明显降低(P 0. 05);观察组上述指标变化更明显(P 0. 05)。观察组的治疗有效率(92. 06%)明显高于对照组(77. 78%),差异有统计学意义(P 0. 05)。结论:小柴胡汤具有抗炎,增强免疫力,调节内分泌功能,降低基质金属蛋白酶水平等作用,提高青春期痤疮的治疗效果。     

脱管散对创伤修复影响的实验研究

目的:以脱管散为载体,通过观察脱管散对大鼠创伤修复模型创面肉芽组织中相关生长因子及细胞外基质表达的影响,试图从分子水平探讨中药外用制剂促进创伤修复的机制。方法:采用经典创伤修复模型,收集创面肉芽组织中不同时期的肉芽组织,经过组织芯片技术处理后,用SABC法检测创面中bFGF、Fn的表达,高倍镜下病理切片观察,采用BI-2000图像分析系统进行定量灰度分析。结果:大鼠创面肉芽组织生长旺盛,创面肉芽组织中细胞所表达的生长因子分布存在差异,在造模后6d治疗组(脱管散组)bFGF表达与阳性对照组、空白对照组存在组间显著性差异(P<0.01);造模后6、14d治疗组Fn表达与阳性对照组、空白对照组存在组间差异(P<0.05)。结论:脱管散能够通过刺激创面内源性bFGF、Fn增加,进而促进创伤的修复。     

电针促进皮肤创伤修复的实验研究

动态观察了电针“足三里”对皮肤切割伤大鼠创伤修复过程中肉芽组织羟脯氨酸含量和胶原纤维灰度的影响。结果显示：电针可提高羟脯氨酸含量,使胶原纤维灰度上升。表明电针具有促进皮肤创伤纤维组织修复的作用。     

重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N的表达、纯化及生物学活性的研究

 目的表达、纯化重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N(rSEB-D9N),了解表达产物rSEB-D9N的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和肿瘤生长抑制作用。方法不同浓度IPTG诱导SEB-D9N突变体原核表达系统pET32a-SEB-D9N-E.coliBL21DE3表达rSEB-D9N,经Ni-NTA亲和层析法纯化rSEB-D9N,10%SDS-PAGE和高效液相色谱检测其纯度。以Vero细胞为靶细胞,进行rSEB-D9N的细胞毒性作用,并计算TCID₅₀值。采用MTT法分别检测不同浓度的rSEB-D9N促人淋巴细胞增殖及抑制KB及MCF-7癌细胞株生长的作用。流式细胞术检测rSEB-D9N刺激人淋巴细胞后CD3、CD4、CD8的表达。结果rSEB-D9N表达产量约占细菌总蛋白30%,纯化后获得纯度为90.48%的rSEB-D9N。rSEB和rSEB-D9N对Vero细胞的TCID₅₀值分别为3.12,8.85μg,10.0,20.0mg·L^-1的rSEB-D9N具有显著的促PBMC增殖的作用(P<0.05),且主要上调CD3,CD4和CD8的表达。5.0～20.0mg·L^-1rSEB-D9N作用的PBMC上清对KB和MCF-7细胞生长均可产生明显抑制作用(P<0.05)。结论获得并纯化了重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白(rSEB-D9N),其细胞毒性作用有所降低,但促人淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用仍较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤相关药物的候选突变体。