淫羊藿素通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成软骨分化

该文研究GDF-5联合淫羊藿素(ICT)诱导BMSCs成软骨分化,并探讨Wnt信号通路在其中的作用。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取P3代细胞分成6组:BMSCs组,ICT组,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组,GDF-5+ICT+XAV-939组,连续诱导培养14 d。倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖变化;RT-PCR检测aggrecan,Col2,Sox9,Dvl1,Gsk3β,β-catenin mRNA表达水平;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白和β-catenin蛋白表达水平。结果提示,与BMSCs组相比,GDF-5组,GDF-5+ICT组,GDF-5+ICT+SB216763组蛋白聚糖Alcian blue染色均明显较深;成软骨分化标记基因aggrecan,Col2,Sox9 mRNA表达水平及Ⅱ型胶原蛋白表达水平,Wnt信号通路相关基因β-catenin mRNA及蛋白表达均逐渐增加,Gsk3βmRNA表达量逐渐减少。相反,相对于GDF-5+ICT组,添加XAV-939组则表现为成软骨分化及Wnt信号通路相关基因Dvl1,β-catenin表达下调,Gsk3βmRNA表达增加,Ⅱ型胶原蛋白及β-catenin蛋白表达水平均下降,上述差异均有统计学意义。GDF-5联合淫羊藿素能够诱导大鼠BMSCs成软骨分化,其中ICT起促进作用。ICT可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCs体外成软骨分化。     

淫羊藿苷影响软骨细胞基质分泌和基因表达的体内研究

目的:研究淫羊藿苷(icariin,Ica)对体内异位组织工程化软骨细胞基质分泌和特异性基因表达的影响,以评估Ica作为软骨组织工程促进剂的可能性。方法:分离、培养新生家兔关节软骨细胞;制备封装在包埋盒中含Ica终浓度为1×10-5M的软骨细胞-胶原水凝胶构建物,体外培养1周后植入家兔背部皮下,分期取材。激光共聚焦显微镜观察Ica对构建物中软骨细胞生长活性的影响;生化方法检测糖胺聚糖(gLycosaminogLycans,GAG)的分泌量;ELISA测定II型胶原(CollagenⅡ,ColⅡ)的合成情况;实时荧光定量聚合物酶联反应检测软骨特有基因表达情况。结果 :在凝胶中载入1×10-5M浓度范围内的Ica可使细胞-凝胶构建物外观更为致密,类似于软骨组织;维持软骨细胞表型及生长活性;促进GAG和ColⅡ的分泌;提高Aggrecan、CollagenⅡ和Sox9等软骨细胞特有基因的表达。结论:Ica可维持体内异位环境下组织工程化软骨细胞表型,促进细胞外基质分泌和软骨特有基因的表达,有望成为软骨组织工程中一种安全有效的促进剂。     

龙胆苦苷对骨性关节炎软骨细胞外基质的影响

目的：观察龙胆苦苷对骨性关节炎软骨细胞外基质保护作用的机制。方法：从关节软骨中提取软骨细胞,体外培养传至原代。随机分为空白对照组、模型组和观察组。空白对照组采用常规培养基,模型组在培养基中添加白细胞介素-1β（IL-1β）诱导构建细胞水平关节炎模型,观察组在模型组的基础上添加龙胆苦苷进行干预,在体外共培养72 h后提取RNA。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法在基因水平检测关节软细胞外基质特异性基因Ⅱ型胶原A1、蛋白聚糖和降解酶基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、血管性血友病因子裂解蛋白酶-5（ADAMTS-5）基因表达变化。结果：与空白对照组比较,模型组软骨细胞Ⅱ胶原蛋白A1、蛋白聚糖的表达降低,差异均有统计学意义（均P<0.01）,MMP-13、ADAMTS-5表达明显增加,差异均有统计学意义（均P<0.01）。与模型组比较,观察组中软骨细胞Ⅱ胶原蛋白A1、蛋白聚糖的表达均出现增加的趋势,其中Ⅱ胶原蛋白A1差异有统计学意义（P<0.05）,MMP-13和ADAMTS-5表达减少,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：龙胆苦苷可上调软骨细胞外基质中Ⅱ胶原蛋白A1、蛋白聚糖的mRNA表达,对骨关节炎的软骨细胞具有保护作用,其作用机制主要是抑制MMP-13的生成。     

牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响

目的研究牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响。方法分离培养原代大鼠骨髓间充质干细胞后,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分成对照组和牛膝提取物组(10、30、50μg/mL)。培养14 d后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,阿利新蓝法检测葡糖胺聚糖含有量,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹(Western blot)检测细胞中Sox-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)水平。SIRT1抑制剂(尼克酰胺)处理细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和免疫蛋白印迹检测SIRT1、Sox-9水平。结果骨髓间充质干细胞表面CD90和CD44呈阳性表达,而CD45和CD34呈阴性表达。与对照组比较,牛膝提取物可显著促进骨髓间充质干细胞细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调细胞葡糖胺聚糖含有量及Sox-9、ColⅡ、Aggrecan水平,以上差异均有统计学意义(P 0. 05),并呈剂量依赖效应。另外,尼克酰胺可抑制牛膝提取物诱导的骨髓间充质干细胞细胞增殖和Sox-9表达升高。结论牛膝提取物可通过上调SIRT1水平来促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化。     

独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠软骨细胞代谢，BMP-7及SIRT1表达的影响

目的:观察独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎(KOA)大鼠关节软骨细胞代谢、骨形成蛋白-7(BMP-7)及沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)的影响,为独活寄生汤的临床应用补充理论依据。方法:采用Hulth法建立KOA模型大鼠,模型成功后采用酶原消化法培养KOA软骨细胞;另将40只大鼠分为独活寄生汤低、中、高剂量组(0.85,1.7,3.4 g·kg~(-1))及硫酸氨基葡萄糖组(硫酸氨基葡萄糖胶囊0.3 g·kg~(-1)),灌胃14 d后处死取血清;将培养细胞分为正常组、模型组、独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组(对应剂量组大鼠血清培养)及硫酸氨基葡萄糖胶囊组(硫酸氨基葡萄糖组大鼠血清培养);采用结晶紫法检测各组软骨细胞增殖能力;采用荧光原位末端转移酶标记法(TUNEL)法检测各组软骨细胞凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组软骨细胞中基质金属蛋白酶-13(MMP-13),MMP-3,Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ),聚集蛋白聚糖(Aggrecan),BMP-7及SIRT1 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测各组软骨细胞中MMP-13,MMP-3,ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1的表达。结果:(1)与正常组软骨细胞比较,模型组细胞增殖能力明显降低,与模型组细胞比较,独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组软骨细胞增殖能力提高(P0.01);(2)与正常组软骨细胞比较,模型组细胞凋亡数量明显增加,与模型组软骨细胞比较,独活寄生汤低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组细胞凋亡数量明显降低(P0.01);(3)与正常组软骨细胞比较,模型组细胞MMP-13,MMP-3表达升高,ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1下降(P0.01);与模型组比较,低剂量组细胞中MMP-13,MMP-3 mRNA及蛋白表达无明显变化;硫酸氨基葡萄糖组及中、高剂量组细胞中MMP-13,MMP-3 mRNA及蛋白表达明显下降,且剂量越高上述蛋白及mRNA表达越低;硫酸氨基葡萄糖组及低、中、高剂量组细胞中ColⅡ,Aggrecan,BMP-7及SIRT1表达升高,且随剂量的增高而升高(P0.01)。结论:独活寄生汤含药血清可通过增加KOA软骨细胞内BMP-7及SIRT1的表达,增加KOA软骨细胞合成代谢、抑制分解代谢,从而起到抑制KOA软骨细胞凋亡,促进软骨细胞再生的作用,进而起到治疗KOA的目的。     

牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨定向分化的实验研究

目的:观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨定分化的作用。方法:密度梯度离心联合骨髓贴壁法分离培养新西兰大白兔BMSCs,取P3代细胞随机分成5组(空白组、完全诱导组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组),连续诱导培养21d,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞学检测Ⅱ型胶原蛋白荧光表达,qRT-PCR检测软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达情况,Western Blot检测Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果:牛膝醇提物高、中、低剂量组与空白组相比Ⅱ型胶原蛋白荧光阳性表达明显;牛膝醇提物高、中剂量组与空白组相比软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原明显增加(P0.05),Western Blot验证Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达明显(P0.05),其中牛膝醇提物高剂量组效果最佳(P0.01),与完全诱导组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:牛膝醇提物能够诱导兔BMSCs成软骨分化,其具体作用机制有待进一步研究。     

葡甘露聚糖凝胶对宫颈炎大鼠CollagenⅠ、CollagenⅢ表达的影响

目的：探讨葡甘露聚糖凝胶对宫颈炎大鼠宫颈组织中Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）的调节作用。方法：采用苯酚胶浆进行阴道内注射建立宫颈炎模型,造模结束后进行局部给药治疗,将18只雌性SD大鼠造模后分为模型组、葡甘露聚糖凝胶高、中、低剂量组（1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1、0.3 g·kg-1）、复方甲硝唑阴道栓组（0.4 g·kg-1）、凝胶基质组各3只,另外3只作为空白组。阴道内灌注给药7天后,RT-PCR和Western blot法检测大鼠宫颈组织中CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA及蛋白的表达。结果：RT-PCR法结果显示与空白组比较,模型组大鼠宫颈组织中CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表达均明显降低（P﹤0.01）;与模型组比较,葡甘露聚糖凝胶给药组大鼠宫颈组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达有不同程度的提高（P﹤0.01或P﹤0.05）。Western blotting法检测宫颈组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表达：与空白组比较,模型组大鼠宫颈组织中CollagenⅠ、C...     

荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制

目的 探究荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎（KOA）软骨退变的作用机制。方法 将46只8周龄雄性SD大鼠随机分为空白组（13只）与造模组（33只）。采用改良Hulth法复制大鼠KOA模型,造模2周后,随机选择2组中各3只大鼠拍摄膝关节MRI,鉴定造模是否成功。造模成功后,将30只造模组大鼠随机分为模型组、治疗组和对照组,每组各10只。各组予相应药液灌胃12周后,切取右侧胫骨平台软骨组织,采用Real-time PCR法检测软骨组织中LncRNA H19、miR-675、Ⅱ型胶原（CollagenⅡ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因水平。结果 与空白组比较,模型组软骨组织LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan基因水平均明显降低（P<0.05）;与模型组比较,治疗组与对照组中LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan基因水平水平均明显升高（P<0.05）。结论 荣筋拈痛方可能通过上调LncRNA H19/miR-675促进CollagenⅡ、Aggrecan表达,从而延...     

生长分化因子-5对大鼠关节软骨细胞生长代谢的影响

目的:观察生长分化因子-5对成熟软骨细胞生长代谢的影响。方法:分离和培养大鼠关节软骨细胞成功后,将细胞分为5组,在各组培养液中分别添加浓度为0 ng.mL-1、1 ng.mL-1、10 ng.mL-1、100 ng.mL-1、1 000 ng.mL-1的生长分化因子-5,采用倒置显微镜观察、MTT比色、阿辛蓝染色、逆转录聚合酶链式反应、胶原免疫荧光染色检测软骨细胞增殖、蛋白多糖合成、Ⅱ型胶原合成及胶原表型变化。结果:①倒置显微镜下观察:经生长分化因子-5培养的软骨细胞生长活跃,细胞数量增加,对数生长期提前。②MTT比色和阿辛蓝染色:吸光度值比较,各组间差异有统计学意义(F=368.032,P=0.001;F=240.048,P=0.008);生长分化因子-5浓度越高,MTT比色和阿辛蓝染色的吸光度值越大。③逆转录聚合酶链式反应电泳:随GDF-5浓度的增加,各组443 bp带亮度变化不大,而268 bp带亮度变化越来越明显。④免疫荧光染色:软骨细胞在含100 ng.mL-1GDF-5的培养液中培养21 d后,只表达Ⅱ型胶原,而不表达Ⅰ、Ⅹ型胶原。结论:生长分化因子-5可刺激成熟软骨细胞的增殖,促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,并能维持软骨细胞的生物学特性。     

桃仁膝康丸激活软骨细胞自噬延缓骨性关节炎软骨退变的研究

目的观察桃仁膝康丸(TRXK)对外科手术诱导的大鼠骨性关节炎(OA)软骨退变的保护作用并探讨其与软骨细胞自噬的关系。方法将健康雄性SD大鼠40只随机分为:假手术组、模型组、TRXK组和TRXK+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,采用改良的Hulth法制备大鼠膝关节OA模型。术后2周开始TRXK组和TRXK+3-MA组给予TRXK 1.25 g·kg-1·d-1灌胃,TRXK+3-MA组同时给予3-MA 1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射,连续用药12周。光镜下观察软骨组织形态学变化,并进行Mankin评分,Real-time PCR法检测膝关节软骨组织中Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶13(MMP13)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)m RNA的表达,Western Blot法检测软骨组织中ULK1、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)蛋白质的表达。结果与模型组比较,TRXK能明显降低Mankin评分,升高软骨组织中COL2A1和Aggrecan,而降低MMP13和ADAMTS5 m RNA表达(P0.05);另外,TRXK能提高ULK1、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白质表达(P0.05)。结论桃仁膝康丸可以通过诱导软骨细胞自噬延缓或阻止外科手术诱导的大鼠膝关节OA的软骨退变,其激活软骨细胞自噬的机制有待进一步研究。     

黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的特性

目的观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响,为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝(MTT)法筛选出黄芪多糖的合适浓度,取F3代细胞,采用随机数字表法分为对照组和诱导组(神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导),采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脂蛋白酯酶(LPL)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示,在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显,甲苯胺蓝染色阳性,而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达,LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞,而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。     

身痛逐瘀汤含药血清通过NF-κB通路抑制TNF-α诱导的大鼠髓核细胞退变的作用机制

目的 探讨身痛逐瘀汤含药血清是否可通过介导核因子-κB(NF-κB)通路抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的大鼠髓核细胞退变。方法 将成年雄性SD大鼠随机分为4组制备空白血清和身痛逐瘀汤高、中、低剂量含药血清。取从大鼠尾盘获得并传代到第3代的髓核细胞,分为5组培养：空白组加20%空白大鼠血清,模型组加20%空白大鼠血清和20 ng/mL TNF-α,身痛逐瘀汤高剂量组加20%身痛逐瘀汤高剂量含药血清和20 ng/mL TNF-α,身痛逐瘀汤中剂量组加20%身痛逐瘀汤中剂量含药血清和20 ng/mL TNF-α,身痛逐瘀汤低剂量组加20%身痛逐瘀汤低剂量含药血清和20 ng/mL TNF-α,均培养48 h。采用RT-PCR法检测髓核细胞中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2家族相关x蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况,采用Western blot法检测细胞中p-IKKα/β、IKKβ、p-IκBa、IκBa、p-p65、...     

加味阳和汤含药血清联合转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 探究加味阳和汤含药血清联合转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。方法 全骨髓贴壁培养法分离培养SD大鼠BMSCs,并进行流式细胞术鉴定;CCK-8实验筛选出加味阳和汤含药血清促进BMSCs增殖的最佳有效浓度;将第3代BMSCs分为空白对照组、加味阳和汤含药血清组(含药血清组)、TGF-β1组(阳性对照组)、加味阳和汤含药血清联合TGF-β1组(联合组),诱导分化21 d后,阿利新蓝染色检测软骨特异性基质蛋白糖胺聚糖生成;RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测软骨分化标记基因SOX-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因蛋白表达。结果 (1)阿利新蓝染色显示,空白对照组未见明显软骨特异性基质蛋白糖胺聚糖(呈蓝色)产生,其余3组可见明显糖胺聚糖生成,其中联合组效果最佳;(2)与空白对照组比较,Aggrecan、ColⅡ及SOX-9的基因蛋白表达均明显升高(P<0.05),其中联合组效果最佳(P<0.01),且明显优于含药血清组和阳性对照组。结论 加味阳和汤含药血清在一定浓度范围...     

牛膝总皂苷体外干预人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原表达及最佳浓度的实验研究

目的:观察牛膝总皂苷(TSA)体外干预人膝骨关节炎软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)表达水平及最佳浓度.方法:将人膝骨关节炎软骨细胞进行分离、培养、鉴定,并将其分为6组,分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ml组.制备TSA存储液及6组不同TSA浓度DMEM/F12(D/F12)培养基,分别用6组培养基对P3代软骨细胞培养并进行细胞形态学观察;采用CCK-8法检测软骨细胞P1、P2、P3传代增殖情况,观察其生长曲线;采用Western-blot法检测P3代软骨细胞CollagenⅡ蛋白表达、RT-PCR法检测Collagen Ⅱ mRNA表达.结果:软骨细胞体外分离并培养成功,经甲苯胺蓝染色鉴定细胞为软骨细胞来源;CCK-8法绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律,P3代软骨细胞增殖速度高于P1、P2代;Western-Blot法检测结果显示,Collagen Ⅱ蛋白表达量浓度为0.5 mg/ml时达最高,RT-PCR法检测结果显示,各组浓度AST能促进软骨组织Ⅱ型胶原mRNA表达上调,以0.5 mg/ml组最明显(P＜0.05).结论:TSA能体外有效促进软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,以0.5 mg/ml浓度最明显,具有促进软骨修复的作用,具体作用机制有待进一步研究.     

维药买朱尼含药血清对IL-1β作用下大鼠软骨细胞MMP-13、Type-ⅡCollagen表达的影响

目的:观察维药买朱尼含药血清对IL-1β作用下体外培养的大鼠关节软骨细胞Type-ⅡCollagen、MMP-1、MMP-13表达的影响,并进一步探讨维药买朱尼防治OA的作用机制。方法:从1周龄SD大鼠关节软骨中分离培养原代软骨细胞,经鉴定后选用第二代细胞随机分为空白对照组、模型组、维药买朱尼组,培养第3d时模型组、维药买朱尼组采用细胞因子IL-1β(10ng/ml)继续培养,分别在培养后第24h、36h、48h采用RealTimePCR方法检测并分析各组软骨细胞中MMP-13、Type-ⅡCollagen的表达情况。结果:在第24h时各组MMP-13表达增加,Type-ⅡCollagen有一定降低,但无统计学差异;而在第36h和48h时空白对照组与模型组MMP-13、Type-ⅡCollagen表达差异均有统计学意义(P0.05),维药买朱尼组较模型组MMP-13与Type-ⅡCollagen的表达在48h、72h时间点有显著性差异(P0.05)。结论:维药买朱尼可抑制IL-1β对Type-ⅡCollagen的降解和破坏作用,并能抑制IL-1β对MMP-13的诱导和激活作用。     

补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨缺损修复机制探讨

目的:研究中药补肾壮筋汤联合西药盐酸氨基葡萄糖作用于大鼠,观察大鼠膝软骨缺损修复过程中中西医药物的联合应用是否能够更为有效的促进大鼠膝软骨缺损的修复,为膝软骨损伤能够得到更好的治疗提供新的理论依据及方法。方法:将SPF级大鼠(64只)随机分为5组,sham组,模型组,补肾壮筋汤组(7.5 g·kg~(-1)·d~(-1)),盐酸氨基葡萄糖组(7.5 g·kg~(-1)·d~(-1)),补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖组[(7.5+7.5) g·kg~(-1)·d~(-1)]对大鼠进行药物灌胃,通过大体观察、扫描电镜观察4,8,12周鼠膝软骨缺损修复情况;实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测各组Ⅱ型胶原(CollagenⅡ),聚集蛋白聚糖(Aggrecan) mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CollagenⅡ蛋白表达。结果:4,8,12周与模型组比较,补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖组软骨缺损处透明软骨填充,钻孔处软骨修复平整、光滑,与周边软骨组织融合为一体,明显优于其他各组; Real-time PCR,Western blot结果显示,与模型组比较,4,8,12周各给药组CollagenⅡ,Aggrecan mRNA和蛋白的表达显著增高(P0.01),补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖组与补肾壮筋汤组、盐酸氨基葡萄糖组比较增高最为显著(P0.01);通过扫描电镜观察与模型组比较,补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖组可见软骨缺损处虽然可见缺损边界,再生软骨组织表面平坦,基本与周边正常软骨组织融合,结构形态已趋于正常软骨组织,明显优于其他各组。结论:中西医药物联合应用能够明显促进大鼠膝软骨缺损的修复,从mRNA及蛋白表达水平及微观结构分析了中西医结合治疗软骨损伤的可能机制。     

补骨脂素对大鼠腰椎间盘软骨细胞炎性退变的影响

目的探讨补骨脂素延缓椎间盘退变的内在机制。方法体外分离1月龄雌性SD大鼠腰椎间盘软骨板,采用组织块法培养,通过HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫荧光进行细胞辨别、鉴定。通过细胞增殖实验和RT-PCR法进行补骨脂素最佳浓度筛选。取第3代生长状况良好的椎间盘软骨细胞,以每孔1×105的浓度将细胞置于6孔板内,分为空白对照组、白细胞介素-1β(IL-1β)诱导组(10ng/ml)、补骨脂素组(IL-1β10ng/ml+补骨脂素最佳浓度),每组3孔,检测各组Ⅱ型胶原基因(Col2a1)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS-5)、IL-1β和环氧化酶-2(COX-2)mRNA的表达。结果补骨脂素浓度在100、150、200、400μM时,细胞活性较浓度为0时明显减弱(P0.01)。补骨脂素在12.5、25μM时较浓度为0时能上调Col2a1 mRNA表达(P0.05或P0.01)。补骨脂素组Aggrecan mRNA高于空白对照组(P0.01);与IL-1β诱导组比较,补骨脂素组Col2a1 mRNA升高,ADAMTS-5 mRNA降低(P0.01)。结论补骨脂素可以一定程度缓解IL-1β诱导的椎间盘软骨细胞的退变进程,并对IL-1β炎性信号通路的相关因子产生影响。     

五福饮对大鼠退变椎间盘聚蛋白聚糖与Ⅱ型胶原表达的影响

目的观察五福饮对大鼠退变椎间盘聚蛋白聚糖与Ⅱ型胶原表达的影响。方法将48只SD大鼠分成空白对照组、模型组及五福饮组各16只,模型组及五福饮组大鼠应用细针纤维环穿刺结合肿瘤坏死因子-α椎间盘内注射进行造模,造模成功后3组大鼠分别给予生理盐水、生理盐水及五福饮灌胃治疗8周。采用Micro-CT检测脊柱退变情况,HE染色观察椎间盘退变特征,RT-PCR检测椎间盘聚蛋白聚糖与Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果造模后,大鼠椎间盘出现明显退变特征,表明造模成功。灌服五福饮8周后,大鼠造模椎间隙相对高度及组织学退变均有改善。五福饮组大鼠与模型组大鼠相比较,椎间盘聚蛋白聚糖与Ⅱ型胶原mRNA表达均有明显提高(P0.05)。结论五福饮可防治椎间盘退变,提高聚蛋白聚糖与Ⅱ型胶原表达可能是其作用机制。     

淫羊藿苷对IL-1β诱导的炎症性软骨细胞表型与代谢的影响

目的探讨淫羊藿苷(Icariin,ICA)对IL-1β诱导的炎症软骨细胞表型的影响。方法分离培养大鼠关节软骨细胞,利用白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导原代软骨细胞,模拟骨关节炎软骨细胞炎症内坏境。实验分为空白组、模型组(含IL-1β10 mg/L)、ICA低浓度组(含10 mg/L IL-1β和1μmol/L ICA)和ICA高浓度组(含10 mg/L IL-1β和5μmol/L ICA)。利用Western blot的方法检测II型胶原蛋白(collagen-II,Col-II)和蛋白聚糖(aggrecan)蛋白表达情况,利用RT-PCR法检测collagen-II、aggrecan、MMP-13、ADAMTS-5 m RNA表达情况。结果培养3天时,与模型组比较,ICA对炎症软骨细胞collagen-II m RNA和蛋白表达有明显的促进作用(P0.05),ICA高浓度组对collagen-II m RNA和蛋白表达的促进作用较低浓度组更强(P0.05);与模型组比较,ICA对炎症软骨细胞aggrecan m RNA和蛋白表达有明显的促进作用(P0.05),不同浓度的ICA促进作用差异不明显。与模型组比较,ICA可抑制MMP-13、ADAMTS-5 m RNA表达(P0.05),ICA高浓度组抑制MMP-13 m RNA表达作用更显著(P0.05),不同浓度ICA对ADAMTS-5 m RNA表达差异不明显。结论 ICA可以通过抑制MMP-13、ADAMTS-5的表达,促进炎症软骨细胞collagen-II和aggrecan的表达,从而维持软骨细胞表型和促进基质代谢。     

Genistein、Na3Vo4对椎间盘软骨细胞作用效应的研究

目的:探讨染料木黄酮(Genistein)、正钒酸钠(Sodium orthovanadate,Na3Vo4)对椎间盘软骨终板软骨细胞的作用效应。方法:使用酶消化法培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞,将不同浓度Genistein(15、35及55μmol/L)、Na3Vo4(10、20及30μmol/L)加入培养的底3代软骨细胞中,培养7d,MTT检测软骨细胞增殖率,RT-PCR检测Ⅱ型、Ⅸ型胶原和Aggrecan mRNA的表达,定量RT-PCR检测IGFR、PTPn1、PTPn1、IGFR mRNA的表达。结果:干预7d后,15μmol/L Genistein组各项指标与模型组比较变化不明显(P>0.05);35μmol/L Genistein组与模型组比较,软骨细胞增殖率、Ⅱ型胶原及aggrecan mRNA表达显著降低(P<0.01),IGFR mRNA表达较模型组有所降低,但无显著性差异(P>0.05);55μmol/L Genistein组与模型组比较,软骨细胞增殖率、aggrecan基因表达显著下降(P<0.01),Ⅸ型胶原、IGFR mRNA表达较模型组有所降低(P<0.05);各浓度Genistein组PTPn1mRNA表达无显著变化。与模型组比较,10μmol/LNa3Vo4组各项检测指标变化不明显,30μmol/L Na3Vo4组Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达明显降低(P<0.01),20及30μmol/L Na3Vo4组软骨细胞增殖率明显下降(P<0.01),Aggrecan以及PTPn1mRNA表达显著降低(P<0.05),IGFRmRNA表达无显著变化(P>0.05)。结论:适当剂量Genistein、Na3Vo4在椎间盘软骨终板软骨细胞增殖、胶原表达以及aggrecan表达等方面起重要作用,Genistein可特异性抑制PTKs中IGFR基因表达,适当剂量Na3Vo4可抑制PTPs中PTPn1的基因表达,降低软骨细胞生物学功能。