蚂蟥与螺蛳耗氧率、窒息点相关性及最适投喂方式的研究

采用静水呼吸室法测定不同质量蚂蟥和螺蛳的耗氧量、耗氧率和窒息点,生物量测定法研究不同投喂方式对蚂蟥生长的影响。结果表明:25℃条件下,蚂蟥和螺蛳耗氧量与质量呈正相关(P0.05),窒息点随质量增大而增大(P0.05)。蚂蟥耗氧率与质量呈负相关,螺蛳耗氧率随质量增大呈先增大后减小趋势。投喂方式对蚂蟥终末质量、SGR,WGR和死亡率影响不显著,对进食比例影响显著(P0.05)。蚂蟥最适投喂频率为3 d投喂1次,应根据蚂蟥和螺蛳各阶段耗氧量及窒息点,结合养殖密度、水体面积以及换水频率,科学合理计算出螺蛳的投喂量。     

蚂蟥冬眠临界温度的研究

采用生物学观测法、静水法、3,5-二硝基水杨酸比色法、对棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法观测和测定不同温度下蚂蟥生物学特征、耗氧量、耗氧率、消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。结果表明,随着温度的降低,蚂蟥活动减弱、进食减少,4℃后不食不动,头部和尾部弯曲呈"弯月"状;耗氧量、耗氧率以及消化道酶活性随温度下降逐渐下降,10℃后下降趋势减缓,4℃后趋于稳定,不随温度降低而变化;在4℃状态40 d过程中,淀粉酶变化不显著,脂肪酶、蛋白酶活性在20d时有所降低,其中脂肪酶下降后又轻微上升后保持较低水平。结论,4℃为蚂蟥冬眠的临界温度,"弯月"状可作为其冬眠状态的标志。     

不同温度和pH对蚂蟥消化道酶活性影响的初步研究

目的:测定和比较不同温度和pH条件下蚂蟥Whitmania pigra消化道内淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶的活性.方法:实验设计了从7～ 52℃10个温度梯度,pH从2.2 ～11.2共10个梯度,测定不同温度及pH条件下蚂蟥消化道内淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活力的变化.结果:当温度在7 ～52℃,pH2.2～11.2,蚂蟥消化道内脂肪酶在温度为37℃,pH为8.2时酶活最大;淀粉酶在温度为37℃,pH为5.2时酶活最大;蛋白酶在温度为42℃,pH为3.2,9.2时酶活较大.结论:蚂蟥消化道内脂肪酶的最适温度为37℃,最适pH为8.2;淀粉酶最适温度为37℃,最适pH5.2;蛋白酶最适温度为42℃,最适pH为3.2,9.2.     

外源甲基睾酮对自然越冬蚂蟥生长及性腺发育的影响

为了探究外源甲基睾酮(MT)对蚂蟥自然越冬期间生长、性腺发育的影响,在蚂蟥冬眠前,使养殖水体中MT质量浓度分别0. 1,1. 0,10. 0,100. 0,150. 0μg·L~(-1),养殖6周后停止添加,让蚂蟥自然冬眠,60 d出冬眠后测定蚂蟥生长指标、性腺指数、内源性类固醇激素及药材品质;同时采用组织切片技术,对蚂蟥精卵细胞进行观察。结果表明,蚂蟥体质量、存活率以及性腺指数随外源MT浓度升高呈先升高后降低趋势,雄性腺指数在外源MT质量浓度10. 0μg·L~(-1)时最大,雌性腺指数在外源MT质量浓度1. 0μg·L~(-1)时值最大;蚂蟥存活率在外源MT质量浓度10. 0μg·L~(-1)时最高,而体质量在质量浓度100. 0μg·L~(-1)时达到顶峰(P0. 05)。精巢中初级精母细胞数量与外源MT浓度呈负相关,次级精母细胞以及精细胞数量则呈先升高再降低趋势,100. 0μg·L~(-1)外源MT处理时次级精母细胞数量最多;卵巢中卵母细胞数量、体积及卵黄颗粒随外源MT浓度升高呈先升高再降低趋势,在外源MT质量浓度100. 0μg·L~(-1)时最高。蚂蟥内源性类固醇激素随外源MT浓度升高呈先升高后降低趋势,内源雄激素和孕激素质量浓度在100. 0μg·L~(-1)外源MT处理时最高(P0. 05),而雌激素在外源MT质量浓度10. 0μg·L~(-1)时浓度最高(P0. 05)。添加外源MT后,蚂蟥水分、酸不溶性灰分、酸碱度和抗凝血酶活性等指标均符合《中国药典》2015年版药材水蛭标准,且抗凝血酶活性均升高,1. 0μg·L~(-1)外源MT处理时显著高于对照组(P0. 05)。综上,冬眠前短期添加1. 0～100. 0μg·L~(-1)外源MT,能够促进冬眠蚂蟥生长、精卵细胞发育,提高抗凝血酶活性。     

不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长和内在品质影响的研究

采用生物量测定、3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法等方法研究不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长、消化酶活性、生化指标和内在品质的影响。结果表明:蚂蟥的最终质量,特定生长率(SGR),增重率(WGR),淀粉酶,脂肪酶,蛋白酶活力,SOD,CAT,ALP酶活性与密度呈反比,与换水频率呈正比(P0.05);换水频率与水中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢呈负相关,与溶氧量呈正相关;养殖密度和换水频率对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、p H和抗凝血酶活性影响不显著。因此,每亩50万条为较适宜的养殖密度,每72 h 1次为较适宜的换水频率。     

Cu2+富集与释放对蚂蟥生长、内在品质及相关基因表达影响的研究

该研究旨在探究Cu^2+富集与释放对蚂蟥生长和内在品质影响,以及蚂蟥不同组织对Cu^2+富集与释放规律。在安全浓度范围内,在蚂蟥日常养殖中添加适宜浓度Cu^2+,养殖50 d后停止添加Cu^2+继续养殖50 d,测定不同时期蚂蟥生长指标、不同组织Cu^2+含量、以及内在品质变化。结果表明,0.014 mg·L^-1 Cu^2+能显著促进蚂蟥生长(P<0.05),降低死亡率;在Cu^2+富集初期40 d内蚂蟥特定生长率、消化酶活性、生长与消化酶相关基因表达量显著高于对照组(P<0.05),释放期无明显差异;Cu^2+组蚂蟥免疫酶活性、免疫酶基因表达量与对照组比呈现先升高后降低的趋势(P<0.05);蚂蟥不同组织对Cu^2+富集能力为消化道>肌肉>皮肤,释放能力为肌肉>消化道>皮肤;Cu^2+组蚂蟥内在品质、水蛭素基因表达量与对照组无显著差异。综上,Cu^2+能提高蚂蟥消化酶、抗逆酶活性及相关基因的表达,促进蚂蟥生长、提高免疫能力,但并不影响药材水蛭内在品质,蚂蟥至少需要30 d才能完全释放体内富集的Cu^2+。     

黄芪对蚂蟥生长和免疫及相关基因表达的影响

为了研究黄芪对蚂蟥生长和免疫影响及作用机制,在蚂蟥养殖水中添加黄芪,使养殖水中黄芪质量分数分别为0,0.01%,0.03%,0.05%,0.07%,0.09%。养殖60 d后测定生长性能、消化酶和抗逆酶活性、内在品质以及生长激素(growth hormone,GH)、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor,IGF-1)和消化酶相关基因相对表达量;同时观察和统计热应激对蚂蟥生存状况的影响,测定热激蛋白HSP70和免疫相关基因相对表达量。结果表明:黄芪组最终体质量、增重率和特定生长率、消化酶和抗逆酶活性以及GH,IGF-1和消化酶相关基因相对表达量均高于空白组,且随浓度的增加呈先升后降趋势,其中0.05%组显著高于其他组别(P<0.05);黄芪组与空白组蚂蟥内在品质无显著性差异。蚂蟥存活率与热应激处理时间呈负相关;随着热应激处理时间的延长,蚂蟥HSP70和免疫相关基因相对表达量呈先升高后降低趋势,热应激24 h时最高;黄芪组存活率、HSP70和免疫相关基因相对表达量均高于空白组,其中0.05%组显著高于其他组别(P<0.05)。综上,黄芪能提高蚂蟥消化酶、抗逆酶活性及相关基因的表达,促进蚂蟥生长、提高免疫能力、增加其抗热应激能力。建议在蚂蟥实际生产中添加0.05%黄芪以提高养殖效益。     

蚂蟥不同月龄口器组织学及组织化学研究

利用石蜡切片、HE及AB-PAS染色法研究不同月龄蚂蟥口器组织结构的变化。结果显示1~3月龄口径与口宽增加幅度较小,分别为0.6,0.3 mm;3~4月龄增幅最大,为1.2 mm;4~6月龄口径、口宽达到最大值,基本不再增加。口唇位于口部最前端的外缘,外被薄的保护膜,随着生长口膜上皮细胞由立方上皮细胞到柱状细胞再到长柱状细胞。口腔深处共有3个颚,较大1个居背面,另外2个较小的分居左右腹侧,与肌肉质的咽相连,颚从外到内由角质层、上皮细胞层、肌层、颚腔组成,颚上均存在具有分泌酸性颗粒的乳突,从2月龄开始存在大量酸性颗粒状物质;口腔由内向外由黏膜层、黏膜下层、肌层组成,周围有着丰富的围口神经。咽由内向外由黏膜层、肌层、浆膜层构成,黏膜褶皱随生长增高增厚,黏膜上皮由复扁平上皮变为柱状上皮,肌层发达且随着生长逐渐增厚,4月龄厚度最大。蚂蟥黏液细胞主要由管状、梨状2种形态4种着色类型构成,不同时期AB-PAS染色变化不大,口唇1月龄黏液细胞少,2,3月龄黏液细胞增多且主要为Ⅱ型黏液细胞,口腔中含有较多Ⅰ型黏液腺细胞,咽部肌层下的结缔组织层分布着较少的Ⅱ型黏液细胞。     

吸食对蚂蟥不同组织抗凝血酶活性影响的研究

为了研究吸食对蚂蟥不同组织抗凝血酶活性的影响,取成年蚂蟥吸食后第1,3,5,7,11天的唾液腺、嗉囊、肠和肌肉称重,同时采用凝血酶直接滴定法测定各组织抗凝血酶活性。结果表明,蚂蟥唾液腺在吸食后不同阶段的抗凝血酶活性均显著高于其他组织(P0.05)。在吸食后11 d内,肌肉组织抗凝血酶活性随着停食时间的延长呈先升后降趋势,最高峰出现在吸食后第5天(P0.05);唾液腺、嗉囊、肠在吸食后第1天抗凝血酶活性最高(P0.05),随停食时间的延长呈逐渐降低趋势。整体抗凝血酶总量在吸食后第5天最高(P0.05),比吸食后第1,3,7,11天分别提高49.5%,73.5%,69.1%,126.0%。综上,吸食行为和食物均可诱导唾液腺和消化道分泌抗凝活性物质;投喂第5 d对蚂蟥进行采收加工其药材水蛭抗凝血酶总量最高。     

四逆汤水提物对缺氧-复氧损伤心肌细胞的保护作用

目的:观察四逆汤水提物(Sini decoction,SND)对培养乳鼠心肌细胞在缺氧复氧条件下的直接保护作用.方法:动态采集并分析正常对照组、缺氧复氧组、四逆汤水提物8.0、17.9、40.0、89.4、200μg/ml给药组心肌细胞在缺氧前,缺氧30、60、90、120、150、180min以及复氧30min和60min细胞搏动频率及收缩面积的变化;比色法测定培养液中LDH;使用MTT法测定心肌细胞存活量.结果:心肌细胞搏动频率及收缩幅度随着缺氧时间延长而逐渐降低,四逆汤水提物给药组(除8.0μg/ml组外)较缺氧复氧组搏动维持时间长,且200.0μg/ml组在复氧后能恢复搏动.缺氧3h缺氧复氧组乳酸脱氢酶(LDH)漏出率较正常对照组升高(P＜0.05);除8.0μg/ml组外,四逆汤水提物不同浓度组LDH漏出率较缺氧复氧组降低,存在浓度-效应关系.复氧1h,各给药组LDH漏出率也较缺氧复氧组低.缺氧复氧组与正常对照组比较,存活的心肌细胞减少(P＜0.01);给药组心肌细胞存活量较高,呈浓度-效应关系.结论:四逆汤水提物可延长缺氧状态下心肌细胞的搏动时间,减缓收缩力的衰减,减少细胞膜损伤及提高缺氧复氧心肌细胞的存活量,表现出对心肌细胞的直接保护作用.     

蚂蟥Guamerin基因的克隆及吸食后时空表达分析

该研究对非吸血蛭蚂蟥体中弹性蛋白酶抑制剂基因(wp Guamerin)进行了克隆和生物信息学分析,同时对该基因在蚂蟥不同组织、不同吸食阶段的时空表达特点进行研究。结果表明,蚂蟥wp Guamerin基因全长295 bp,相对分子质量为9 145.95 Da,包含1个编码83个氨基酸的开放阅读框,与吸血蛭Guamerin氨基酸序列相似性均在29%~65%;wp Guamerin编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋、延伸链、折叠和无规则卷曲组成。wp Guamerin在肌肉中表达量显著高于唾液腺,在嗉囊和肠中无表达;吸食后wp Guamerin在肌肉和唾液腺的表达量分别在第1,3天达到最高。因此,wp Guamerin是有别于吸血蛭Guamerin的小分子多肽蛋白,在蚂蟥消化道中不表达,主要在肌肉中表达,吸食行为可刺激蚂蟥肌肉和唾液腺wp Guamerin基因的表达而不能诱导蚂蟥消化道wp Guamerin的表达。     

肾脏周细胞-肌成纤维细胞转分化的病理机制及中药的干预作用

在肾脏,周细胞(pericyte)是肾间质中肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)的主要来源。周细胞-肌成纤维细胞转分化(pericyte-myofibroblast transition,PMT)是肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)重要病理机制之一,其中,周细胞的募集、活化与分离以及周细胞源性促红细胞生成素缺乏是促进RIF形成的主要原因。在PMT启动过程中,周细胞的活化及其与微血管的分离受控于多条信号转导途径,这些信号通路包括转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)通路、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)通路、血小板源性生长因子受体(platelet derived growth factor receptor,PDGFR)通路;阻断这些信号通路不仅能抑制PMT,而且,能遏制肾脏毛细血管减少,改善RIF。临床上,很多中药复方、单味中药及其提取物等都具有改善RIF的明确疗效,其中,一些中药的干预作用可能与周细胞及其PMT相关。基于此,"PMT及其药物干预的研究"将会成为中药抗脏器纤维化研究领域的重要发展方向。     

石寿棠《医原》学术思想溯源

本文在系统梳理石寿棠《医原》、《温病合编》相关原文记载的基础上,对《医原》的成书年代,石寿棠的学医经历,及其学术思想的传承起源进行了研究,以澄清目前有关石寿棠学术思想源流认识的不清之处,并据相关资料推测了石寿棠与同时代医家余国佩、吴鞠通的关系,为石寿棠学术思想的进一步研究打下了基础.     

清气解毒方含药血清干预呼吸道合胞病毒感染人喉癌上皮细胞Hep-2的体外实验研究

目的探讨清气解毒方抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的作用及可能机制。方法 3只新西兰白兔分为空白血清组、利巴韦林组和清气解毒方组,每组1只。清气解毒方组灌胃量为36. 32 mg/(kg·d),利巴韦林组给药量为18. 24 mg/(kg·d),空白血清组给予50 ml生理盐水灌胃,均连续灌胃3天后制备含药血清。检测RSV半数感染量(TCID50)并筛选清气解毒方、利巴韦林药物最大无毒浓度用于后续实验。Hep-2细胞以1×10~5/ml种于96孔板中,分为细胞组、病毒组、利巴韦林组和清气解毒方组,每组设6个复孔。利巴韦林组加入利巴韦林血清,清气解毒方组加入清气解毒方血清,细胞组和病毒组加入细胞维持液。分别培养48、72、96 h后检测各组细胞病毒抑制情况,96 h后观察各组细胞周期及凋亡率。结果呼吸道合胞病毒A亚型(Long株) TCID50为10-4. 581/100μl。最终筛选出浓度为40%的清气解毒方含药血清作为其最大细胞无毒浓度,即0. 363 g/ml;浓度为50%的利巴韦林含药血清作为其最大细胞无毒浓度,即0. 228 mg/ml。与细胞组比较,感染后48、72、96 h病毒组OD值明显降低(P <0. 01);与病毒组比较,利巴韦林组和清气解毒方组在48、72、96 h时OD值均明显升高(P <0. 05或P <0. 01)。清气解毒方组在48、72、96 h病毒抑制率分别为42. 1%、57. 0%、66. 6%,低于同时间利巴韦林组的51. 2%、69. 6%、77. 3%。与细胞组比较,病毒组G1期明显升高,S期明显降低,凋亡率亦升高(P <0. 05或P <0. 01);与病毒组比较,利巴韦林组与清气解毒方组G1期明显降低,S期和G2期明显升高,凋亡率亦降低(P <0. 05或P <0. 01)。结论清气解毒方具有一定的体外抗RSV作用,效果略差于利巴韦林。     

无症状肾源性血尿患者虚实证预测指标的初步筛选

目的初步筛选无症状肾源性血尿患者虚实辨证的实验室预测指标。方法采集257例无症状肾源性血尿患者临床资料,包括患者年龄、性别、病程、合并症、血压、尿隐血、尿蛋白、尿沉渣、尿微量白蛋白(m Alb)、糖化血红蛋白、24小时尿蛋白定量、球蛋白(GLO)、血糖、尿素、肌酐、胱抑素C、白蛋白、胆固醇、甘油三脂、尿酸、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血红蛋白(Hb)、超敏C反应蛋白、血沉、补体C3、补体C4、IgA、IgG、IgM、全血黏度、血浆黏度等指标。同时由两位高级职称中医师对患者进行虚实辨证,根据辨证结果将患者分为虚证组及非虚证组,实证组和非实证组。比较虚证组与非虚证组、实证组与非实证组各指标的差异。用二元Logistic回归得出对虚证、实证候诊断有独立预测意义的指标。结果 257例患者中虚证组157例,非虚证组100例。与非虚证患者相比较,虚证患者在性别、病程、收缩压、m Alb <20 mg/L、尿沉渣5万/ml～50万/ml、糖化血红蛋白、GLO、甘油三脂、尿酸、HDL-C、Hb、IgG方面,差异具有统计学意义(P <0. 05),其中m Alb、GLO在独立预测无症状肾源性血尿虚证时具有统计学意义(P <0. 05)。实证组患者32例,非实证组225例。与非实证患者比较,实证组在性别、Hb、LDL-C方面差异有统计学意义(P <0. 05或P <0. 01),其中Hb和LDL-C在独立预测无症状肾源性血尿实证时具有统计学意义(P <0. 05)。结论 m Alb、GLO可作为无症状肾源性血尿虚证诊断的独立预测指标,Hb和LDL-C可作为无症状肾源性血尿实证诊断的独立预测指标。     

基于纳滤传质模型探索有机溶液对麻黄碱的强化分离效应

该文基于纳滤传质模型探索有机溶液对麻黄碱的强化分离效应规律,以麻黄碱为目标成分,采用Box-Behnken中心组和设计建立数学模型,筛选乙醇浓度与溶液pH对纳滤截留的敏感区域,进而基于纳滤传质数学模型,拟合传质系数与有机溶剂浓度的相关性。实验结果表明,截留相对分子质量450,pH 6. 0,乙醇浓度由20%升高至40%,传质系数呈下降趋势,麻黄碱出现强化截留分离行为,在相同条件下,溶剂更换成甲醇和乙腈,也产生相似的强化截留分离效应,3种常见有机溶剂的浓度与强化效应呈正相关,表现为乙腈>乙醇>甲醇。以麻黄碱为例探索有机溶液环境下的纳滤分离机制研究,为中药生物碱类成分的常温化纳滤分离提供理论支撑。     

麦冬与山麦冬中多元指标成分的比较分析

建立超快速液相色谱-三重四级杆/线性离子阱质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)同时测定麦冬类药材中甾体皂苷、高异黄酮、氨基酸与核苷类共33种指标成分含量测定的方法,并结合多元统计分析对麦冬类商品药材进行比较分析。采用SynergiTMHydro-RP 100(2. 0 mm×100 mm,2. 5μm)色谱柱,以0. 1%甲酸水-0. 1%甲酸乙腈为流动相,流速0. 4 mL·min-1,梯度洗脱,多反应监测模式检测(MRM);用聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据处理和分析。结果显示,33种目标成分在一定浓度范围内线性关系良好(r> 0. 999 0);加样回收率为96. 23%102. 0%,RSD均小于5. 0%。麦冬与山麦冬化学成分差异明显,找出7种差异显著的化学成分。该研究为麦冬类药材内在质量的综合评价和全面控制提供依据,同时为麦冬与山麦冬的药材鉴别提供新的方法参考。     

不同产地薄荷药材有机酸与黄酮类成分分析

目的:建立同时测定薄荷药材中5种有机酸和黄酮类成分含量的高相液相色谱方法,比较不同产地薄荷药材各成分的差异。方法:采用HPLC-PDA法,Waters XBridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液,流速为1.0 m L/min,柱温30℃,检测波长285 nm,进样量10μL。采用灰色关联度分析(GRA)对其进行综合评价。结果:5种有机酸和黄酮类成分在一定范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9999;平均加样回收率95.76%~103.00%,相对标准偏差为0.8%~2.41%。同一产地中的不同成分、不同产地中的同一成分均存在一定差异,安徽-太和-1的薄荷样品综合品质评价最优。结论:该实验建立的方法准确可靠,可同时测定薄荷样品中咖啡酸、迷迭香酸、橙皮苷、蒙花苷、香叶木素的含量,为薄荷非挥发性成分的测定提供了可行方案。