蛤蚧及其混伪品基于12S rRNA序列的Bar-HRM鉴定研究

目的:为实现蛤蚧与其常见混伪品的高效鉴别和掺伪检测,并建立蛤蚧中药材的DNA条形码-高分辨率熔解曲线(Bar-HRM)鉴别方法。方法:本研究收集了7个物种48份动物样品和10份蛤蚧粉。基于12S核糖体核糖核酸(12S rRNA)序列对蛤蚧及其6种常见混伪品进行高分辨率熔解曲线(HRM)鉴定研究并测序验证。采用HRM方法进行灵敏度和掺伪检测分析,并对市场蛤蚧粉进行检测验证。结果:蛤蚧及其6种常见混伪品均可通过12S rRNA-HRM曲线分析进行鉴别;可实现纳克级的准确检测,最低掺伪检测限为1%;10份市售蛤蚧粉中6份质量可疑。结论:基于12S rRNA序列的Bar-HRM技术可实现蛤蚧与其常见混伪品的准确鉴别,在掺伪检测中具有独特优势,对市场药材的快速检测及质量评估有一定应用价值。     

基于COI 条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA 分子鉴定

目的：利用COI 序列对蛤蚧药材及其常见混伪品进行DNA 条形码鉴定,为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法：以COI 作为条形码序列,对蛤蚧实验样品进行DNA 提取,PCR 扩增和双向测序,用MEGA6.0 对所有11 个物种的103 份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果：所有实验样品均可以获得COI 序列,蛤蚧COI 序列种内平均K2P 距离为0.005,种内最大K2P 距离为0.013,基于COI 序列构建的NJ 树中蛤蚧单独聚在一支,与其混伪品可以相互区分。结论：运用COI 条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品,为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。     

快速PCR技术鉴别中药材蛤蚧的方法研究

目的:建立简单快速鉴别蛤蚧的特异性PCR方法。方法:对比蛤蚧及其伪品细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)序列,设计蛤蚧特异性PCR鉴别引物,优化特异性PCR条件,对蛤蚧及其7种常见混淆品进行扩增及荧光检测。结果:扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光检测,所有蛤蚧药材均能扩增出约400 bp的特异性条带,加入SYBR Green I染料后,在365 nm下出现强烈绿色荧光,混伪品不具特异条带和绿色荧光,鉴别操作可在30 min内完成。结论:快速PCR结合荧光染料检测可快速鉴别蛤蚧及其常见伪品,为蛤蚧的快速鉴定提供了新的思路和方法。     

基于12S基因对中成药中药用乌梢蛇的分子鉴定研究

目的 建立一种适用于中成药中乌梢蛇药材掺伪问题的分子鉴别方法。方法 收集组方有乌梢蛇的中成药11种、乌梢蛇及其混伪品15种。对所有样品进行总基因组DNA提取,基于12S基因片段对乌梢蛇及其混伪品对比分析,根据差异位点设计乌梢蛇通用引物序列、特异引物序列以及荧光定量所用引物和探针,分别采用不同聚合酶链式反应(PCR)方法扩增乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇成分,优化反应体系并对方法进行耐受性和适应性的考察。结果 建立了乌梢蛇的特异性PCR技术,乌梢蛇正品均在200 bp附近处有一清晰条带,其他混伪品无条带。建立荧光定量PCR鉴别方法,适用于DNA含量低的中成药检测。结论 通过特异性引物PCR扩增可以有效鉴别乌梢蛇药材,通过荧光定量PCR检测法可以有效鉴别乌梢蛇药材及中成药中乌梢蛇的真伪问题。方法具有特异、快速、灵敏的特点,为乌梢蛇及中成药中乌梢蛇药材的真伪鉴别提供参考。     

基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究

目的：基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行TaqMan探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法。方法：本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定。结果：在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,TaqMan探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出。结论：基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异TaqMan探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考。     

基于亲缘关系的红蛤蚧与黑蛤蚧药效再评估

目的 基于药用亲缘学原理,对红、黑蛤蚧药效情况进行再评估.方法 通过Mega软件,采用MP法构建系统发育树,基于系统发育树判断红、黑蛤蚧之间的亲缘关系,并依此探讨红、黑蛤蚧及药效之间的关系.结果 红、黑蛤蚧在系统树上相互嵌合在一起,不能各自形成独立分支(单系),来自不同产地的红、黑蛤蚧分别构成了4个独立支系,这与红、黑蛤蚧截然可分的概念相悖.结论 红蛤蚧可能具有和黑蛤蚧相似的药效,不同地区的红、黑蛤蚧药效可能存在差异.该研究旨在为红、黑蛤蚧的药效及化学成分研究提供前瞻性的建议,即开展相关研究应基于亲缘关系,分别对不同产地红、黑蛤蚧样品进行分析.     

蛤蚧真伪鉴定试剂盒的研制与性能评价

目的 蛤蚧作为我国的名贵中药材,资源少,市场需求量大,导致市场常有混伪品出现,因此研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒,为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法 以蛤蚧细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)为靶基因,设计特异性引物,确定合适的PCR反应条件,研制蛤蚧真伪鉴定试剂盒。结果 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后,正品可以扩增出约250～500bp之间(473bp)的扩增条带,而伪品无蹼壁虎和石龙子均没有条带。结论 研制出的蛤蚧真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性好,适用范围广,操作简单,结果准确,可以为蛤蚧的DNA分子鉴别提供技术保障,可以保证药源无误,药效可靠。     

基于微生物快速鉴定系统对金黄色葡萄球菌耐药性鉴定新评估方法的建立

目的:探讨微生物快速鉴定系统(MALDI-Biotyper System)用于快速鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a),临床分离金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.a)耐药性情况的可行性。方法:通过采用微生物快速鉴定系统及肉汤稀释法进行鉴定质控、临床分离金黄色葡萄球菌的耐药性情况,并将微生物快速鉴定系统检测结果与肉汤稀释法最低抑菌浓度(MIC)值进行比较分析,最后通过同步鉴定铜绿假单胞菌耐药性情况确定微生物快速鉴定系统的准确性及适用性。结果:微生物快速鉴定系统评分鉴定结果显示敏感质控菌株金黄色葡萄球菌评分值大于2.000,耐药质控菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.a,MRSA)评分值在1.700~2.000。临床分离金葡菌评分鉴定结果均在1.700~2.000,显示耐药,与肉汤稀释法MIC值结果一致。同时,无关质控敏感菌株铜绿假单胞菌的系统评分鉴定值大于2.000,显示敏感,其本身为敏感菌株,结果一致。结论:微生物快速鉴定系统评分方法可以用于金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌耐药性情况的快速鉴定。     

蛤蚧及其伪品的微量元素测定和鉴定意义

本文对蛤蚧及其伪品的微量元素进行了测定,建立了TE(微量元素)特征图谱,找出了正品蛤蚧与伪品蛤蚧TE特征图谱的差异,分析了微量元素与临床疗效的内在联系性以及伪品蛤蚧不能替代正品.     

基于matK序列的积雪草与其易混品的分子鉴定方法分析

目的:积雪草容易与多种混淆品相互混淆,本研究拟基于mat K序列探讨积雪草与其混淆品鉴定的新方法。方法:从Gen Bank核酸数据库下载积雪草、过路黄、连钱草和乌蔹莓的mat K序列,应用Clustal X 2.1软件进行SNP鉴别位点分析,应用MEGA5.0软件计算种内种间(K2P)遗传距离和构建邻接(NJ)系统聚类树。结果:获得积雪草与过路黄各5个mat K序列及连钱草和乌蔹莓各1个mat K序列,分析显示积雪草与其混伪品的mat K序列存在较大差异,具有近百个SNP位点,且其中多是积雪草特有的,可用于分子鉴定。且积雪草最大种内K2P遗传距离0.001,远远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离0.242~0.293,构建的系统发育树显示积雪草与其混淆品可明显分开。结论:综合以上分析,mat K序列为鉴定积雪草及其混淆品提供了新的分子鉴定方法。     

蛤蚧口腔炎症治疗方法的研究

目的 对蛤蚧常发病-口腔炎症进行研究.方法 试验①组用配制好的高锰酸钾消毒液给蛤蚧进行体表消毒后,清除口腔脓块,涂搽碘甘油,然后给蛤蚧口服复方新诺明,最后注射抗菌素,按以上处理方法连续使用7 d后,停药3 d,继续用药处理3 d,再外用3 d.试验②组试验方法和过程同试验①组,但不注射抗生素.对照组患口腔炎症的蛤蚧,只作体表消毒,不再进行其他药物处理.结果 经过16 d治疗后,试验①组总治愈率为86.67%;试验②组的总治愈率为75.00%,其治愈率略低于试验①组,但差异不显著(P>0.05);而对照组患病蛤蚧全部死亡,其治愈率显著低于试验组(P<0.05).结论 复方新诺明对蛤蚧口腔炎症有明显的治疗效果.     

两种快速鉴定甘草方法的比较

目的:建立快速检测中药材甘草的荧光定量PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)两种技术,并对它们的特异性和灵敏性进行比较。方法:以中药材甘草作为实验对象,提取DNA后,用设计的PCR引物及LAMP引物组合分别对甘草进行普通PCR、荧光定量PCR以及LAMP实验,检测引物的特异性,同时建立模板DNA的浓度梯度,对荧光定量PCR及LAMP的灵敏性进行检测。结果:甘草的特异性序列可以通过荧光定量PCR得到有效扩增,而与甘草相近的混伪品结果显示阴性。荧光定量PCR最低可检测到甘草的浓度为0.67×10~(-4)ng/μL。在LAMP特异性检测中,甘草出现浊度值,其他混伪品显示阴性。灵敏度性检测中,LAMP检测在60 min反应时间内同样检测到的甘草的最低DNA浓度为0.67×10~(-4)ng/μL,反应产物加入荧光染料SYBR GreenⅠ后反应液呈现肉眼可观察的明显的亮绿色。结论:LAMP检测和real-time PCR检测具有相似的特异性、灵敏度和精确性,但LAMP检测方法更为简单、方便,所需时间更短,而且不需要昂贵的仪器。因此,LAMP检测中药的方法更适合于对中药材甘草检测的推广使用。     

蛤蚧对S180荷瘤鼠免疫逃逸功能的影响

目的观察蛤蚧(GJ)对S180荷瘤鼠免疫逃逸功能的影响。方法将60只雌雄各半昆明种小鼠随机分正常组、模型组、环磷酰胺组(CTX)、GJ低剂量组、GJ中剂量组、GJ高剂量组。分组给药14d后,计算抑瘤率及免疫器官指数;通过ELISA、MTT法,分别检测血清IL-4、IL-10的表达和脾淋巴细胞增殖情况。结果 1与模型组比较,GJ低剂量组肿瘤生长明显受到抑制(P0.05)。GJ低、中、高各剂量组抑瘤率分别是23.9%、22.3%、16.7%。2与CTX比较,GJ低剂量组脾脏指数明显升高(P0.05),GJ中、高剂量组胸腺指数明显升高(P0.05)。3与模型组比较,GJ低、中剂量组IL-4含量明显降低(P0.05),GJ各组IL-10含量降低,无显著性差异(P0.05)。4与模型组比较,GJ高剂量组能显著促进Con A诱导的脾淋巴细胞增殖能力(P0.05)。结论 GJ可多途径干预免疫逃逸,从而抑制肿瘤细胞生长。     

基于ITS序列和化学模式识别方法鉴定金蝉花及其混淆品独角龙

基于ITS序列对金蝉花与独角龙进行分子鉴定,并建立HPLC指纹图谱结合化学模式识别方法,鉴别金蝉花及其混淆品独角龙.分别提取10批金蝉花与5批独角龙的基因组DNA,通过PCR扩增ITS序列并测序,利用MEGA 7.0软件比较二者的稳定差异位点并构建系统发育树;采用HPLC建立金蝉花与独角龙指纹图谱,运用相似度评价、聚类...     

基于DNA序列的石斛属药用植物鉴定研究进展

本文从核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三方面,综述了目前常用DNA序列在石斛属药用植物的分子鉴定和物种分类研究中的进展。文献显示,目前用于石斛属物种分子鉴定研究的DNA序列主要有核ITS/ITS2、LEAFY,叶绿体rbcL、matK、trnH-psbA、rpoB、rpoC1、trnL-F、rbl16、trnl intron和线粒体基因组nad1 intron2,这些DNA序列均对石斛属药用植物鉴定具有借鉴意义。笔者对叶绿体全基因组序列作为“超级条形码”在石斛属植物中应用的可行性进行了展望,以期为石斛属药用植物的鉴定研究提供参考。     

基于ITS2序列的博落回属植物鉴定研究

目的:采用ITS2序列对博落回属药用植物进行鉴定。方法:通过对来自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陕西、重庆的30个博落回属植物ITS2序列进行扩增和测序,并对其进行扩增效率及测序成功率、碱基构成、种内和种间变异分析及NJ系统进化树分析来评估ITS2序列鉴定效果。结果:博落回属药用植物ITS2序列长度在500 bp以内,扩增效率和测序成功率为100%,并获得30条博落回ITS2序列。结论:ITS2序列可以有效准确鉴别博落回属植物。     

广西蛤蚧、泰国蛤蚧及其混伪品海蛤蚧(红瘰疣螈)的生药鉴定

对中药商品蛤蚧（广西蛤蚧，泰国蛤蚧ＣｅｋｋｏｇｅｃｋｏＬ）及其混伪品海蛤蚧（红瘰疣螈ＴｙｌｏｔｒｉｒｏｎｖｅｒｕｃｏｓｕｓＡｎｄｅｒｓｏｎ）进行了药材性状、药材鳞片显微特征、化学定性反应、紫外光谱、ＨＰＬＣ高效液相色谱的鉴别研究。实验结果，海蛤蚧与广西蛤蚧、泰国蛤蚧比较有明显区别，不应混用；广西蛤蚧与泰国蛤蚧的比较差异较小；为蛤蚧的准确鉴定和质量评价提供了鉴别依据。     

基于psbA-trnH序列DNA条形码技术的绵马贯众鉴定研究

利用psbA-trnH序列对绵马贯众药材、基原植物进行真伪鉴定。对实验样本的psbA-trnH序列进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增及产物测序,为扩大研究范围,从Gen Bank中下载了3属8种植物的psbA-trnH序列。利用DNAMAN 8.0软件进行峰图的查看、拼接及比对,使用MEGA 6.0软件计算K2P遗传距离并建立系统聚类树对其进行分析。结果显示psbA-trnH序列可对绵马贯众、其基原植物粗茎鳞毛蕨,以及同科属植物进行鉴别,其中绵马贯众与其基原植物粗茎鳞毛蕨的psbA-trnH序列完全一致,并可与其他易混药材及植物明显区分。表明psbA-trnH序列对绵马贯众药材、基原植物及其混伪品的鉴别具有可行性,为后续蕨类药材的鉴定研究提供一定的科学基础。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

基于ITS2序列的翻白草与委陵菜分子鉴定

目的 应用DNA条形码技术对翻白草及易混品委陵菜进行分子鉴定,保障药材质量和临床用药安全。方法 提取翻白草及委陵菜的基因组DNA,扩增内转录间隔区2（ITS2）序列并双向测序,所得序列用SeqMan软件校对、拼接;在线双序列比对翻白草对照药材（F_R）及委陵菜对照药材（W_R）的ITS2序列,并预测其二级结构;从GenBank下载部分相关序列,运用MEGA X软件进行多序列比对,分析序列变异位点,计算种内、种间遗传距离,采用邻接法（NJ）构建系统进化树。结果 所有样品均成功扩增出ITS2序列,翻白草和委陵菜的ITS2序列长度均为210 bp。双序列比对结果表明,F_R与W_R的ITS2序列相似性为92.9%,二级结构存在明显差异。多序列分析结果表明,翻白草ITS2序列平均鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比为63.0%,存在2个变异位点,种内遗传距离为0~0.009 6;委陵菜ITS2序列平均G+C占比为64.4%,存在5个变异位点,种内遗传距离为0~0.019 3;种间遗传距离为0.054 8~0.075 8。NJ树结果显示,翻白草、委陵菜聚为不同分支,可明显区分。结论 利用ITS2序列可以准确鉴别翻白草与委陵菜,为保障其安全用药提供了新的技术手段。