欧洲花楸糖基转移酶基因的全长克隆与表达分析

目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。     

何首乌糖基转移酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆何首乌Polygonummultiflorum糖基转移酶基因PmUGTs,并对其进行生物信息学以及差异表达分析。方法基于何首乌转录组数据,利用PCR扩增Pm UGTs全长cDNA并进行生物信息学分析;使用autodock4软件进行分子模拟对接;运用q RT-PCR检测基因在不同器官中的表达差异。结果克隆得到4条Pm UGTs,分别命名为Pm UGT1、Pm UGT2、PmUGT3、PmUGT4基因,开放阅读框(ORF)长度分别为1509、1506、1464和1476 bp;编码503、502、488与492个氨基酸;蛋白相对分子质量分别为56 940、54 780、54 350和54 620。Pm UGTs氨基酸序列中含有UGT高度保守的PSPG盒结构域,其二级结构主要由无规则卷曲与α-螺旋组成。进化树分析表明,Pm UGT1、PmUGT2、PmUGT3与拟南芥的UGT蛋白距离较近,Pm UGT4则与蒺藜苜蓿UGT亲缘关系最近。根据autodock4结果可知Pm UGT1、Pm UGT3、Pm UGT2与Pm UGT4蛋白上的残基分别可以与鹰嘴豆芽素A、罗汉果醇、白藜芦醇通过氢键连接。q RT-PCR结果表明,Pm UGTs表达量均在叶中最高。结论为进一步研究何首乌糖基转移酶基因的功能及何首乌中糖苷类化合物的生物合成途径奠定基础。     

金铁锁糖基转移酶UGT71G1的克隆与生物信息学分析

目的克隆金铁锁糖基转移酶全长基因,并进行生物信息学分析。方法根据转录组数据,反转录获得全长c DNA,通过生物信息学软件对该基因蛋白特性及系统发育树进行分析。结果克隆得到c DNA全长序列,命名为UGT71G1,该c DNA全序列长1402 bp,包含一条1107 bp完整开放阅读框,编码368个氨基酸,预测相对分子质量为41.05KD,等电点6.03,在155位到336位置处存在高度保守UDPGT结构功能域,经多重序列比对与同科植物香石竹具有很高的同源性。结论成功克隆、分析了金铁锁UGT71G1基因,为金铁锁有效成分合成关键酶基因及调控机制研究提供基础。     

菘蓝木脂素类糖基转移酶基因IiUGT349克隆及功能表征北大核心CSCD

对菘蓝转录组数据进行系统挖掘,获得110条假定糖基转移酶。利用原核表达和体外酶促体系,获得了1条新的木脂素糖基转移酶基因,暂命名为IiUGT349。活性检测发现IiUGT349能催化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷。生物信息学分析表明,IiUGT349的开放阅读框(ORF)为1 401个碱基,编码467个氨基酸,编码的蛋白质理论等电点为5.96,相对分子质量为52.77 kDa。系统发育树分析显示IiUGT349和已报道的木脂素糖基转移酶同源性较低,归属于UGT90家族,可能代表了一类新的木脂素糖基转移酶。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示IiUGT349在根、茎、嫩叶和叶中均表达,其中在茎中表达量最高。体外酶促反应显示IiUGT349对落叶松树脂醇最佳反应时间为12 h,最佳反应温度为45℃。亚细胞定位发现IiUGT349定位于植物细胞质和细胞核中。该研究克隆得到了1条新的属于UGT90家族的木脂素糖基转移酶IiUGT349,为深入研究此关键酶基因功能和菘蓝木脂素糖苷生物合成途径奠定了基础,对木脂素糖苷活性成分的合成生物学研究有重要意义。     

金铁锁糖基转移酶PtT1的克隆与生物信息学分析

目的:克隆金铁锁糖基转移酶(PtT1)全长基因,并进行生物信息学分析。方法:根据转录组数据,克隆金铁锁PtT1全长c DNA,命名为PtT1,并通过生物信息学软件对该基因进行蛋白结构预测和构建进化树等分析。结果:克隆得到PtT1基因,其cDNA全长1529bp,ORF长1377bp,编码458个氨基酸,相对分子质量为51.25KDa,等电点5.80,定位于线粒体,与同科植物香石竹糖基转移酶基因Dc T227具有很高的同源性。结论:成功克隆、分析了金铁锁PtT1基因,为金铁锁该基因的后续功能鉴定提供了基础。     

滇重楼可溶性无机焦磷酸酶基因的克隆及原核表达研究

目的为了研究可溶性无机焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophosphatase,s PPase)基因在滇重楼生长发育中的功能,对滇重楼的s PPase基因进行了克隆、序列分析和原核表达研究。方法根据滇重楼c DNA文库中筛选到的s PPase的EST序列,克隆了滇重楼可溶性无机焦磷酸酶基因Pps PPase的c DNA全长序列;运用生物信息学的方法对该序列进行相似性比较和同源性分析,预测编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析;将Pps PPase插入到原核表达载体p EASY-E1上,并导入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行诱导表达。结果滇重楼中Pps PPase的开放阅读框ORF为621bp,编码206个氨基酸,与高粱中s PPase的氨基酸序列相似性最高为94%;Pps PPase编码的蛋白相对分子质量是23.4k Da,理论等电点p I为5.6,特异识别区域即位于98-104位之间即DNDPMDV。成功构建了原核表达载体p EASY-E1-Pps PPase,并导入到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经SDS-PAGE分析表明Pps PPase在大肠杆菌中能够表达,当IPTG诱导2h时表达量较高。结论首次从滇重楼中克隆得到可溶性无机焦磷酸酶基因Pps PPase,为滇重楼生长发育分子机制的研究提供参考。     

光果甘草GgUGE基因的克隆和序列分析

目的:通过克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase,UGE)基因并进行生物信息学分析,探究光果甘草UGE基因与甘草酸生物合成分子调控之间的潜在关系。方法:从光果甘草主根中提取RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆得到UGE基因c DNA序列,测序并进行序列分析。结果:成功克隆得到一条长度为1 121 bp的光果甘草UGE基因(Gg UGE) c DNA序列,包含1个长度为1 053 bp的开放阅读框(ORF),共编码350个氨基酸残基,在Gen Bank上对所得c DNA序列进行注册,序列注册号为MK638908。序列分析表明Gg UGE基因编码蛋白为不稳定亲水蛋白,理论相对分子质量为39. 02 k Da,等电点为6. 13,不含信号肽,无跨膜区,二级结构以α-螺旋为主,保守结构域含有葡萄糖4-差向异构酶基因家族结构域。Gg UGE基因的c DNA序列和氨基酸序列聚类分析结果表明其与豆科植物亲缘关系最近,而与杨柳科植物亲缘关系较远。结论:首次克隆得到了光果甘草Gg UGE c DNA序列,对其进行了生物信息学分析,为后续Gg UGE基因的功能研究以及甘草酸生物合成分子调控机制的解析提供参考。     

红花黄酮类糖基转移酶基因CtUGT49功能表征及酶学特性分析

红花作为传统的活血化瘀中药，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等药理活性。黄酮糖苷是红花植物的主要生物活性组分，糖基转移酶作为活性糖苷化合物生物合成的下游后修饰酶，具有重要的研究意义。该研究基于红花转录组数据分析，挖掘到一条糖基转移酶基因CtUGT49,对其进行了系统的生物信息学分析和酶学性质考察。该基因开放阅读框(ORF)长度为1 416 bp,编码471个氨基酸残基，相对分子质量约为52 kDa。系统进化分析表明，该糖基转移酶属于UGT73家族。体外酶促结果显示，CtUGT49可催化柚皮素查尔酮生成樱桃苷和南酸枣苷；催化根皮素生成的主产物为根皮苷和三叶苷，并且具有良好的底物宽泛性。通过蛋白异源表达与纯化得到较为纯净的重组蛋白CtUGT49后，进行CtUGT49催化柚皮素查尔酮的酶学性质考察。结果显示，CtUGT49催化反应的最适pH为7.0,最适温度为37℃,反应8 h后，底物转化率达到最高。采用米氏方程计算CtUGT49的酶活常数K_m=209.90μmol·L^-1,k_cat=48.36 s^-1。该研究...     

党参CpUGPase基因的克隆、序列分析与原核表达

目的为研究党参多糖代谢途径,从党参Codonopsis pilosula根中克隆多糖代谢关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶CpUGPase基因,并进行序列分析和原核表达。方法根据党参转录组中CpUGPase基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得CpUGPase开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体PET-28a-CpUGPase,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 CpUGPase ORF序列全长1 413bp,编码470个氨基酸。序列分析表明,CpUGPase基因具有保守的UGPase_euk催化位点,属于A型糖基转移酶蛋白家族。构建PET-28a-CpUGPase重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约54 900,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论从党参根中克隆得到CpUGPase基因,并建立了稳定的原核表达体系,为进一步纯化CpUGPase蛋白,研究其结构和功能奠定了基础。     

滇重楼甾体糖基转移酶的克隆及功能表征北大核心CSCD

该研究从滇重楼中克隆得到糖基转移酶基因PpUGT2,该基因ORF长度为1773 bp,编码蛋白质的氨基酸为590个。系统进化树分析显示,该糖基转移酶归为UGT80A亚家族,经国际糖基转移酶命名委员会命名为UGT80A49。构建原核表达载体pET28a-PpUGT2,通过诱导蛋白表达及蛋白提取,进行体外酶促实验,以UDP-葡萄糖为糖基供体,薯蓣皂素和偏诺皂素为底物,鉴定了其具有催化薯蓣皂素及偏诺皂素C-3羟基β糖基化的功能,为进一步研究其催化特性,对其进行了底物宽泛性研究,以UDP-葡萄糖为糖基供体,共选取了包括甾体及三萜类化合物在内的15个底物,发现其具有催化甾体类化合物睾酮C-17羟基糖基化的功能。通过同源建模及分子对接,预测了PpUGT2与底物薯蓣皂素及偏诺皂素之间相互作用的关键识别位点。并且通过对配体与多肽的氨基酸扫描,模拟突变,根据复合物的结合亲和力变化,在以底物为中心的5Å范围内,寻找到了最佳突变体,对突变体的设计具有参考意义。该研究为完整解析重楼皂苷生物合成途径以及甾体类糖基转移酶的结构研究奠定了基础。     

姜黄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对姜黄Curcuma longa苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(Cur PAL)全长进行克隆并开展生物信息学分析,为姜黄次生代谢产物的生物合成机制研究奠定基础。方法利用RT-PCR和RACE相结合的方法,以姜黄叶片c DNA为模板,克隆获得Cur PAL全长,进行生物信息学分析。结果克隆的Cur PAL(登录号为KJ780359)全长c DNA为1 293 bp,其中包括5’-UTR 243 bp,3’-UTR 123 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码308个氨基酸;预测蛋白质相对分子质量为33 000,理论等电点p I为5.76;Cur PAL蛋白性质稳定,为可溶性蛋白;Cur PAL编码的蛋白质序列包含与夹竹桃PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点,氨基酸序列多重比较发现,Cur PAL编码的氨基酸序列与中国李、浙江红山茶、拟南芥、辣椒、小果野蕉PAL氨基酸序列的同源性达到75%以上;与姜目类的植物(如小果野蕉)的PAL聚为一支,说明两者亲缘关系较近;通过蛋白质二维、三维结构的预测,表明Cur PAL蛋白为全α型蛋白,由同源四聚体构成。结论首次克隆并获得Cur PAL基因全长c DNA,为姜黄素生物合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据。     

当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因克隆和序列分析

目的克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferases,COMT)编码基因全长c DNA,并对序列进行生物信息学分析。方法提取当归叶片总RNA为c DNA合成模板,利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归COMT全长c DNA,并利用NCBI、Ex PASy网站上的Blast N、Blast P、ORF Finder、Compute PI/Mw、Prot Scale、PROSITE、SWISS-MODEL等序列在线分析工具和MEGA、DNAMAN生物信息学软件对序列进行分析。结果获得COMT全长c DNA序列,并在Gen Bank注册(登录号KP188587)。序列分析表明,克隆的c DNA全长为1 436 bp,其中包括5’-UTR(76 bp)和3’-UTR(362 bp),含有1个1 098 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码365个氨基酸的多肽链;预测蛋白质相对分子质量为40 230,理论等电点(p I)为5.43;无信号肽,具有典型的II型氧甲基转移酶结构域SAM_OMT_II。结论首次克隆当归COMT基因全长c DNA,为当归COMT基因功能研究和当归阿魏酸生物合成与调控的机制研究奠定基础。     

光果甘草CHS基因的克隆与多态性分析

目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS c DNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析。结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS c DNA序列,测序结果显示其一致性99.10%,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条c DNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34%,存在25个变异位点。生物信息学分析表明光果甘草CHS c DNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 k Da,等电点5.75~6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。同源性分析显示,光果甘草CHS c DNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上最近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上最远。结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS c DNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性。     

红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.     

雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析

该研究利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条GGPPS全长c DNA(Gene Bank:KM978333),并对其进行多重序列比对、蛋白结构预测及构建系统进化树等生物信息学分析。所克隆的Tw GGPPS c DNA全长1 857 bp,编码含514个氨基酸的蛋白序列,相对分子质量为57.13 k Da,等电点为7.85,具有5个保守域和2个功能域,亚细胞定位预测显示其可能位于质膜上,多重序列比对及系统进化树结果显示与其他植物GGPPS家族具有较高同源性。实验首次克隆了雷公藤GGPPS基因,为进一步研究雷公藤甲素等二萜化合物生物合成途径奠定基础。     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达。方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基因相对表达量,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。结果:PpUGT1和PpUGT7分别长1 827 bp和1 380 bp,分别编码608和459个氨基酸,相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa,其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶,PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶。两蛋白均为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,均与同类蛋白具有较高的保守性。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,PpUGT1的表达量由高到低依次为根>叶>花>茎,PpUGT7的表达量由高到低依次为茎>叶>花>根。此外,成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白。结论:克隆得到PpUGT1和PpUGT7基因,证明其在不同植物器官中存在差异表达,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础。     

异叶天南星查尔酮合成酶和异构酶基因的克隆及蛋白的结构性质分析

查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)是黄酮类物质生物合成途径中的关键酶,该研究从中药异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume,Ah)转录组数据库中筛选出查尔酮合成酶基因(Ah CHS)和查尔酮异构酶基因(Ah CHI),利用RT-PCR技术克隆了它们的开放阅读框(ORF)部分,并对其编码蛋白Ah CHS和Ah CHI的理化性质、表达及结构特点进行分析。Ah CHS的ORF长度为1 176 bp,编码392个氨基酸的蛋白质;而Ah CHI的ORF长度为630 bp,编码蛋白含209个氨基酸。Ah CHS作为对称同二聚体,N端螺旋互相交换,每个单体由2个亚结构域组成,位于2个亚结构域之间交界处的4个保守的氨基酸残基构成了酶的活性中心; Ah CHI的三级结构采用了开放的β-三明治褶皱,1个大的β折叠片层(β4～β11)和1个α螺旋片层(α1～α7)组成其核心结构,其中β4,β5,α4和α6在不同物种间高度保守,部分疏水氨基酸形成了酶的活性位点。系统进化树分析发现Ah CHS与火鹤花CHS亲缘关系最近;而Ah CHI与紫牡丹CHI亲缘关系最近。表达分析表明编码Ah CHS的基因在根和块茎中的表达量明显比叶多,而编码Ah CHI的基因在块茎部位的表达量最高。该研究为Ah CHS和Ah CHI功能的进一步研究及植物黄酮类化合物生物合成途径的解析提供了基础。