氮素形态对颠茄生物碱积累及相关基因表达的影响

莨菪碱和东莨菪碱是颠茄含有的2种主要生物碱,具有重要的药用价值。该研究以颠茄实生苗为材料,设置不同铵硝配比处理,分析不同形态氮素对颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量和生物碱合成的上游产物、信号分子以及关键酶基因表达量的影响。结果显示,铵硝比50∶50更有利于颠茄生物碱的积累和莨菪碱向东莨菪碱的转化。对Put及其合成关键酶的检测发现,腐胺的含量与腐胺合成的关键酶活性变化基本一致,它们都随铵态氮比例的增加而升高,在铵硝比75∶25达到最高;对信号分子NO的检测发现,NO浓度随处理液中硝态氮比例的减小而减小;对PMT,TRⅠ,H6H表达量的检测发现,少量铵态氮增加了根部PMT,H6H基因表达量,铵硝比为50∶50时叶片和根部PMT,TRⅠ,H6H基因都有较高的表达水平。以上结果表明,氮素形态对颠茄莨菪碱和东莨菪碱合成的调控主要通过影响关键酶基因的表达量起作用,铵硝等比供氮条件提高了颠茄叶片中TRⅠ和根部PMT与H6H表达量,因此促进了腐胺向莨菪碱的合成以及莨菪碱向东莨菪碱的转化,使颠茄能够积累更多的莨菪碱和东莨菪碱。     

酵母提取物对颠茄毛状根氮代谢及次生代谢影响的机制探究

以颠茄毛状根为试验材料,向培养基中添加酵母提取物(yeast extract,YE),测定颠茄毛状根氮代谢关键酶的活性,各形态氮的含量,次生代谢前体物质含量,次生代谢途径中关键酶基因相对表达量以及主要托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)莨菪碱和东莨菪碱的产量,初步探究YE诱导合成颠茄毛状根次生代谢产物的机制。结果表明:较对照组而言,氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著升高,谷氨酸脱氢酶(GDH)活性变化不显著。硝态氮,铵态氮含量显著下降,而可溶性蛋白,游离氨基酸,总氮含量均显著升高。此外,YE处理颠茄毛状根提高了次生代谢途径中的前体氨基酸(鸟氨酸和精氨酸)的含量以及代谢前体腐胺的含量,3个关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶基因(putrescine N-methyl transferase,pmt)、托品酮还原酶-Ⅰ基因(tropinone reductase-Ⅰ,tr I)和莨菪碱6-β-羟化酶基因(hyoscyamine 6-β-hydroxylase,h6h)的相对表达量也呈现不同幅度的上升,最终导致莨菪碱和东莨菪碱产量的增多,在处理16 d后分别是对照组的3.09,1.85倍。这说明YE诱导氮代谢关键酶活性升高使氮代谢加速,为次生代谢中含氮化合物的合成提供更多原料,同时通过调控次生代谢途径中关键酶基因的表达,使莨菪碱和东莨菪碱产量提高。     

盐胁迫下外源NO对颠茄氮代谢及次生代谢调控的研究

以颠茄幼苗为实验材料,采用土培法种植,向叶面喷施不同浓度(0,0.05,0.1,0.2,0.5 mmol·L~(-1))NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP),研究在100 mmol·L~(-1) NaCl胁迫下不同浓度SNP、不同处理时间(4,8,12,16 d)对颠茄氮代谢、次生代谢产物含量以及托品烷类生物碱合成途径的前体物质含量、关键酶基因表达量的影响。结果表明,随着盐胁迫时间的延长,颠茄的氮代谢及次生代谢均受到了一定程度的抑制。经不同浓度外源SNP处理,铵态氮含量显著降低,硝态氮、游离氨基酸、可溶性蛋白含量和氮代谢关键酶(NR,GS,GDH)活性显著升高,次生代谢途径中的前体氨基酸及多胺含量均有不同程度的上升;qRT-PCR分析显示,外源SNP处理可有效提高颠茄次生代谢途径中的关键酶基因PMT,TRⅠ,H6H的表达量,从而使莨菪碱和东莨菪碱产量增加。综上所述,外施适宜浓度的SNP能够有效缓解盐胁迫对颠茄氮代谢及次生代谢的抑制作用,提高其耐盐性,当SNP浓度为0.1,0.2 mmol·L~(-1)时效果较为显著。     

体外培养曼陀萝和天仙子毛发根中的莨菪烷衍生物的光谱研究

茄科植物含有丰富的生物碱,尤其是有解痉和麻醉作用的莨菪烷衍生物莨菪碱和东莨菪碱,它们是在茄科植物的根部合成的。近年,通过根器官生产象莨菪烷生物碱这样的天然产物的报道在增多,有希望的结果是通过发生根病土壤杆菌形成毛发根(hairy     

过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究

文章采用代谢工程方法培育东莨菪碱高产转基因颠茄.根癌农杆菌遗传转化颠茄,过量表达东莨菪碱合成途径中限速酶基因h6h(Hnh6h),卡那霉素筛选获得转基因植株,快繁炼苗后,田间栽培至果期.基因组PCR鉴定转Hnh6h基因颠茄.SPSS软件分析转基因与非转基因颠茄株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等性状的差异;HPLC测定其根、茎、叶、果中莨菪碱及东莨菪碱含量;采用qPCR技术测定各组织Hnh6h基因表达量.结果所获得的5个转基因颠茄株系(A8,All,A12,C8,C19)都能同时检测到Kanr和Hnh6h基因,在非转基因颠茄中没有检测到这2个基因;与非转基因颠茄比较,转基因颠茄株系的株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等都没有降低,且部分性状优于对照.转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量最高,且高于莨菪碱;不同转基因颠茄株系叶片中东莨菪碱含量依次为C8 ＞A12 ＞C19 ＞All ＞A8,C8的东莨菪碱质量分数(2.17 mg·g-l DW)比非转基因颠茄(0.42 mg·g-1 DW)提高4.2倍;在转基因颠茄根、茎、叶和果中都检测到Hnh6h基因表达,且在叶片中表达量最高,非转基因颠茄没有检测到Hnh6h基因表达.因此,过表达Hnh6h基因能够打破颠茄的东莨菪碱生物合成的限速反应,从而推动代谢流向东莨菪碱合成方向流动,提高了东莨菪碱合成能力,最终获得了东莨菪碱高含量的转基因颠茄.     

茉莉酸甲酯对曼陀罗毛状根中主要莨菪烷类生物碱成分积累和释放的影响

目的:研究茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ)对曼陀罗毛状根中主要次生代谢产物东莨菪碱和莨菪碱成分的积累和向培养基中的释放的影响.方法:1/2 MS液体培养C58C1农杆菌诱导的曼陀罗毛状根培养18 d后,液体培养基中加入化学诱导子——茉莉酸甲酯,采用HPLC测定MJ处理后不同浓度梯度及不同时间段(0,3,6,9,12 d)曼陀罗毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的含量以及其在培养基中的含量.结果:曼陀罗毛状根经MJ处理后3,6,9,12 d的东莨菪碱的质量分数分别达0.419,0.439,0.431,0.374 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理的1.36,1.42,1.17,1.12倍;莨菪碱的质量分数达1.493,0.817,0.723,0.698 mg·g-1,分别是同时期未经MJ处理曼陀罗毛状根的2.28,1.11,0.63,0.70倍.结论:MJ能显著促进曼陀罗毛状根中东莨菪碱成分的积累并向培养基中释放;MJ能显著促进处理3d和6d后曼陀罗毛状根中莨菪碱成分的积累并向培养基中释放.     

含颠茄生物碱中药及其制剂与西药的配伍禁忌

含颠茄生物碱的中药有洋金花、天仙子、曼陀罗、颠茄、华山参等，均属于茄科植物，含莨菪碱、山莨菪碱、阿托品、樟柳碱等成分。含有颠茄生物碱的中成药有天仙子注射液、洋金花酊、莨菪浸膏、曼陀罗浸膏、复方百部平喘片、华山参片等。现将含颠茄生物碱中药及其制剂与西药的配伍禁忌分析如下。     

白花曼陀罗毛状根的诱导及东莨菪碱和莨菪碱的合成

目的:建立白花曼陀罗毛状根诱导和培养体系并对毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的动态合成进行初步研究。方法:以白花曼陀罗子叶为外植体,利用发根农杆菌C58C1诱导毛状根,测定白花曼陀罗毛状根的生长曲线及东莨菪碱和莨菪碱的动态合成曲线,利用HPLC测定不同毛状根单克隆系中东莨菪碱和莨菪碱的含量。结果:以野生白花曼陀罗的子叶为外植体,消毒后直接诱导毛状根,诱导率达70%,25 d液体悬浮培养的毛状根生物量积累及东莨菪碱和东莨胆碱含量达到最高。获得高产东莨菪碱的毛状根系M2和高产莨菪碱的毛状根系M1,毛状根中东莨菪碱和莨菪碱的积累效率分别是是野生白花曼陀罗叶片中含量的2.53,5.37倍。结论:白花曼陀罗毛状根诱导和培养体系的建立为实现东莨菪碱和莨菪碱的工业化大规模生产奠定基础。     

颠茄AbCYP80F1基因的克隆与功能分析

目的克隆颠茄Ab CYP80F1基因和启动子序列,分析启动子上与调控信号和转录因子相关的调控元件,研究Ab CYP80F1基因超表达对颠茄发根中东莨菪碱积累的影响。方法以莨菪CYP80F1为探针,在颠茄转录组中进行Blastn检索获得同源的unigene。采用RACE技术克隆Ab CYP80F1全长,热不对称PCR技术克隆启动子序列,发根农杆菌浸染法获得超表达AbCYP80F1基因的颠茄发根,对培养的发根中东莨菪碱含量进行HPLC分析。结果克隆得到1 675 bp的全长Ab CYP80F1基因,其编码蛋白与铃铛子的CYP80F1亲缘关系最近。基因上游2 000 bp启动子上包含的顺式作用元件涉及光、无氧、生长素、茉莉酸、赤霉素和低温信号响应,同时包含有MYB、AP2/ERF、WRKY和bHLH转录因子的识别位点。超表达Ab CYP80F1基因使颠茄发根中东莨菪碱含量平均提高了1.8倍。结论 AbCYP80F1是颠茄须根特异性表达的合成途径基因,超表达能提高终产物东莨菪碱含量,Ab CYP80F1可能受到WRKY和bHLH转录因子的调控。     

大孔树脂分离纯化天仙子总生物碱的研究

目的研究大孔树脂分离天仙子中总生物碱的最佳工艺条件。方法采用HPLC法测定,以东莨菪碱、莨菪碱的吸附量和解吸率为考察指标,分别考察东莨菪碱、莨菪碱在5种类型的大孔树脂(LSA5B、LSA21、LSD001、HPD600、D101)上的吸附和解吸附行为,并分析提取液p H、吸附体积流量、洗脱体积流量等参数对分离的影响。结果所比较的5种树脂中,LSA5B型大孔吸附树脂对天仙子总生物碱分离纯化效果最好,富集能力强,最佳富集工艺条件为以1.5 BV/h的体积流量上样,4 BV蒸馏水洗去水溶性杂质,最佳的洗脱溶剂为体积分数为50%乙醇,最佳洗脱体积流量为1.5 BV/h,洗脱用量为10 BV,东莨菪碱和莨菪碱的洗脱率可达74%和86%。结论经LSA5B型大孔吸附树脂纯化的天仙子总生物碱中东莨菪碱、莨菪碱可达1.85%、4.03%。     

用新型HPLC法分析古柯叶中古豆碱

古豆碱(hygrine)是一种存在于许多植物如曼陀罗、莨菪、烟草和古柯中的生物碱。最近,发现该吡咯烷(pyrrolidine)生物碱是莨菪烷(tropane)生物碱莨菪碱和东莨菪碱的前体,这两种物质广泛用于许多药物制剂。植物组织中的古豆碱可用通用的色谱技术如薄层色谱(TLC)和毛细管气相色谱(CGC)进行常规分析。本文报道了提取古柯叶中古豆碱的改进方法和 HPLC 分析方法。     

黔产曼陀罗中东莨菪碱和莨菪碱的分布规律

目的:探索东莨菪碱和莨菪碱含量在曼陀罗植株中的动态变化规律,为合理、有效地开发曼陀罗资源提供理论依据。方法:利用HPLC检测不同时期曼陀罗再生植株各器官中东莨菪碱和莨菪碱的含量。结果:曼陀罗植株中东莨菪碱和莨菪碱的含量在不同时期和器官存在较大的差异,东莨菪碱在开花时期根中含量最高,达0.157mg/g,莨菪碱在种子中含量最高,达0.128 mg/g。结论:曼陀罗各器官中的东莨菪碱和莨菪碱的含量动态变化规律均为先增加后减少。     

诱导子对颠茄毛状根有效成分及代谢关键酶基因表达的影响

目的提高药用植物颠茄Atropa belladonna有效成分的产量,为颠茄在实际生产中提供经济高效的处理方法,为相关药用植物次生代谢的机制研究提供基础性参考。方法通过向培养基中添加4种不同诱导子,包括茉莉酸甲酯(MJ)、硝酸银(AgNO_3)、水杨酸(SA)、酵母提取物(YE),研究诱导子对颠茄毛状根有效成分的积累及代谢途径中的关键酶基因1,4-丁二氨-氮-甲基转移酶(putrescine N-methyl transferase,pmt)基因、托品酮还原酶-I(tropinone reductase-I,tr I)基因和莨菪碱6-β-羟化酶(hyoscyamine-6-β-hydroxylase,h6h)基因表达的影响。实验将0.5 g新鲜颠茄毛状根接种于盛有B5液体培养基的三角瓶中,暗培养12 d后,将培养基更换为含有诱导子的4种新培养基,相同条件下再培养2 d后采集毛状根样品,测定每瓶毛状根的鲜质量、干质量、部分生理指标、托品烷类生物碱的量及3种关键酶基因的表达量。结果 MJ抑制了颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱的产生,pmt、trI基因的表达量与对照组相比也有所下降;AgNO_3虽然抑制了毛状根的生长,但却显著提高了托品烷类生物碱的含量,同时pmt、trI、h6h基因的表达量均升高;SA对颠茄毛状根的生长影响不显著,但使东莨菪碱的含量提高;YE对颠茄毛状根的生长及托品烷类生物碱的含量均有促进作用,pmt、trI、h6h基因的表达量也相应升高。结论 AgNO_3是提高颠茄毛状根中托品烷类生物碱含量的最佳诱导子,YE在促进颠茄毛状根生长的同时也可促进其次生代谢。推断诱导子通过调控某种或某几种关键酶基因的表达来影响生物碱的代谢合成,为生产中提高颠茄毛状根药用成分含量提供了可参考的方法。     

PMT和H6H双基因共转化颠茄发根的植株再生

目的获得1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶(putrescine N-methyltransferase,PMT)和莨菪碱-6β-羟化酶(hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H)双基因共转化的颠茄发根的再生植株。方法选用PMT和H6H双基因共转化的东莨菪碱高产发根单克隆T4,用1/2MS 1.0mg/LNAA固体培养基培养1、5、10d后,转入1/2MS固体培养基中诱导不定芽和不定根,培养条件均为(25±1)℃,55μmol/(m2.s),12h/d。采用PCR扩增检测再生植株的PMT、H6H和NPT-。结果发根在1/2MS 1.0mg/LNAA固体培养基上培养5d后,转入1/2MS固体培养基上培养,60%的外植体能自发长出不定芽,1/2MS 0.1mg/LIBA固体培养基中诱导生根较1/2MS固体培养基强,15d产生的条数平均为9条,形成了完整的再生植株。PCR检测表明所有再生植株均为颠茄的转基因再生植株。结论建立了颠茄转化发根再生体系,为实现颠茄托品烷类生物碱的代谢工程及开展分子育种奠定了基础。     

日本常用生药的定量方法：莨菪根

莨菪根为镇痛镇静药,含有莨菪碱和东莨菪碱。茛菪根中莨菪碱、东茛菪碱的定量用J P XI法和 HPLC 法测定了10个莨菪根样品中莨菪碱和东莨菪碱的含量,并比较了两种方法的测定值。 1 标准品市售氢溴酸东莨菪碱(C_(17)H_(21)NO_4 HBr ·H_2O,pml05～106℃,和光纯药工业产);1-莨菪碱(C_(17)H_(23)NO_3,mp 108～108.5℃,东京化成工业产)。 2 JPXI定量法用该法测定了10g样品(通过48目筛,60℃下干燥8h)中生物碱含量。 5 HPLC定量法样品溶液:精密称取200mg样品于具塞离心管内,加2.0ml 70％甲醇用超声波在室温下处理20min后以3000次/min速度离心5min。取上清液,并用     

茉莉酸甲酯对黄连生物碱含量积累的影响

目的:探究茉莉酸甲酯（MeJA）对黄连中生物碱积累的影响,为进一步研究茉莉酸甲酯对黄连生物碱生物合成途径的分子调控机制提供依据。方法:用100 μmol/L的茉莉酸甲酯喷施黄连幼苗叶片,于处理后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h取样,采用高效液相色谱法对黄连幼苗中的药根碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量进行测定。结果:茉莉酸甲酯处理48 h后的黄连幼苗中药根碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量显著升高,增长率也最高,其中黄连碱对茉莉酸甲酯的响应性更好,处理48 h后的黄连幼苗中黄连碱含量为对照组的3.15倍;96 h茉莉酸甲酯处理后,黄连幼苗生物碱含量有下降趋势。结论:短时间内施加外源性茉莉酸甲酯可显著促进黄连幼苗中生物碱的积累。     

山莨菪中乙酰胆碱酯酶抑制剂的分离

目的:从山莨菪根部的总生物碱提取物中分离乙酰胆碱酯酶抑制剂。方法:山莨菪根经95%乙醇提取、4mol/L HCl和4mol/L NaOH酸碱处理,氯仿萃取,得到总生物碱。采用薄层色谱生物自显影法跟踪分离目标组分,再用改良的Ellman法进一步测定抑制率。利用多种柱色谱分离得到3个化合物(1-3),通过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS波谱方法并与文献比对鉴定化合物的结构。结果:从山莨菪根部的总生物碱提取物中分离得到3个已知化合物,它们分别被鉴定为东莨菪碱,樟柳碱,阿托品,其乙酰胆碱酯酶抑制率分别为45.28%,38.08%和25.10%。结论:莨菪碱衍生物具有较弱的乙酰胆碱酯酶抑制活性。     

洋金花中颠茄生物碱的流动注射分析研究

本文报道以东莨菪碱流通型传感器为流动注射分析电化学检测器,用于洋金花中颠茄生物碱(东莨菪碱、莨菪碱和阿托品等)的流动注射分析,其线性范围可达0.01～10mg/ml东莨菪碱,适宜pH范围为3～7,斜率54.5mv/pc。东莨菪碱平均回收率为98.5％,相对标准偏差为1.9％。     

曼陀罗愈伤组织培养及药用成分莨菪碱探讨

目的:探究曼陀罗愈伤组织的培养条件,并对愈伤组织中的莨菪碱成分进行研究。方法:使用不同的培养基条件对曼陀罗嫩茎进行体外培养,并对愈伤组织中所含有的莨菪碱进行有效分析。结果:与其他培养基比较,MS、1.0mg·L~(-1) 2,4-D条件下,曼陀罗愈伤组织的诱导和继代培养情况较好,且愈伤组织中的主要生物碱成分为东莨菪碱和莨菪碱。结论:MS、1.0mg·L~(-1) 2,4-D是诱导和继代培养曼陀罗愈伤组织的理想条件,工业上可利用该条件进行愈伤组织培养,以便提取更多的莨菪碱供医药上使用。     

止咳平喘合剂中药用成分东莨菪碱的安全范围研究

目的测定止咳平喘合剂中东莨菪碱的含量,根据东莨菪碱的毒性用法用量判定是否符合药用量规定,并判定出止咳平喘合剂的用法用量是否在安全用量范围内。方法色谱柱采用ZORBAX SB-C18柱(4.6×250 mm 5-Micron),流动相为甲醇—水(40∶60∶含0.02 mol·L^-1醋酸钠、0.02%三乙胺、用冰醋酸调至pH为6),流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为205 nm,柱温是30℃。结果氢溴酸东莨菪碱在0.004~>0.016 mg·mL^-1范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率为100.1%,RSD=1.6。止咳平喘合剂成人每次口服量为50 mL,实验得到止咳平喘合剂中东莨菪碱含量为0.0075 mg·mL^-1,换算即得成人每次口服东莨菪碱量为0.375 mg。另《中国药典》2015年版一部规定洋金花内服用量为0.3~>0.6 g,洋金花原料以东莨菪碱计不得少于0.15%,折算东莨菪碱量为0.45~>0.9 mg,得知止咳平喘合剂中东莨菪碱的含量在相关规定的用药安全范围内。结论该方法可用于止咳平喘合剂中东莨菪碱的含量测定,本方法简单便捷、准确度高。