多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0.7 pg/μ1,特异性为100%。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA+/tcdB+为39株,tcdA-/tcdB-为14株。ELISA法检测毒素A/B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A/B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA+/tcdB+。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

艰难梭菌克隆分布及药物敏感性现状分析

目的探讨杭州地区医院获得性腹泻患者艰难梭菌的克隆分布及药敏表型特征。方法对2013年1月-2016年12月间浙江大学医学院附属第一医院及邵逸夫医院医院获得性腹泻患者的粪便标本进行艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)培养初筛,初筛阳性菌株通过PCR扩增及测序分析16-23SrRNA基因及毒素基因(tcdA及tcdB基因),以明确CD菌种以及是否为产毒菌株;以MLST技术对产毒CD菌株进行同源性分析;并对CD菌株进行药敏敏感性试验。结果共培养CD菌株61株,其中54株为产毒菌株,tcdA及tcdB基因阳性菌株数分别为1株(A+B-)和53株(A-B+),未发现毒素基因双阳性菌株;产毒菌株来源于11个不同ST型别,其中7个ST型别为已知的;各ST型别间亲缘关系较远,ST54型别是最主要流行克隆型别占38.9%(21/54),其次是ST2、ST35和ST37,各占比13.0%(7/54);万古霉素及甲硝唑为敏感性最高的药物,未发现耐药菌株,其次是左氧氟沙星、四环素和环丙沙星,耐药率分别为16.6%、31.4%和38.8%,克林霉素及夫西地酸耐药率最高均为96.3%。结论毒素表型A-B+的ST54型艰难梭菌为本地区主要流行克隆,万古霉素和甲硝唑是有效的治疗CDI的抗菌药物。     

中国部分城市艰难梭菌携带毒素基因特征分析

目的了解中国5个城市艰难梭菌携带毒素基因特征,为中国艰难梭菌感染诊治提供试验依据。方法收集2013年6月-2015年6月中国上海、杭州、宁波、郑州和南京5个城市分离自住院患者和环境表面的艰难梭菌,采用多重PCR的试验方法,对所有菌株进行tcdA/tcdB/cdtA/cdtB4个毒素基因检测,分析所携带的毒素基因特征。结果中国5个城市共成功复苏出艰难梭菌408株,371株来自患者的艰难梭菌经多重PCR检测,tcdA+,tcdB+基因阳性299株,阳性率为80.59%,tcdA-、tcdB-阳性44株,阳性率为11.86%;37株来自环境的艰难梭菌经多重PCR检测,tcdA-、tcdB-阳性15株,阳性率40.54%;tcdA-、tcdB+阳性9株,阳性率24.32%;中国部分城市的艰难梭菌携带毒素基因以A+B+毒素基因为主,产双性毒素基因占1.08%。结论研究所揭示的艰难梭菌毒素基因特征应引起临床医师高度关注,尤其是在选择以检测毒素为主的诊断技术时,应考虑不同方法检测毒素基因的能力。     

江苏地区医院艰难梭菌流行病学研究

目的通过对江苏地区两所不同规模医院的高危人群进行艰难梭菌筛查,以了解医院内艰难梭菌的感染和定植,从而为预防艰难梭菌的流行提供参考数据。方法 2015年11月对A医院和B医院高危科室的所有住院患者进行肛门拭子采样,共采集122份标本,所有的标本经厌氧培养,VIDAS荧光酶联免疫技术检测艰难梭菌毒素A/B,同时利用多重PCR检测技术测定其毒素基因。结果 A医院接受检测的104例患者中艰难梭菌培养阳性29例,阳性率为27.88%,其中感染10例、定植19例;B医院的18例患者中艰难梭菌培养阳性9例,阳性率为50.00%,其中感染1例、定植8例;38株艰难梭菌中有25株艰难梭菌A/B毒素检测阳性;多重PCR结果显示,25株为tcdA和tcdB双阳性,4株tcdA阳性tcdB阴性,9株tcdA和tcdB双阴性,38株艰难梭菌均未检测到二元毒素基因。结论江苏地区不同规模医院的高危科室均存在艰难梭菌感染和传播的风险,对高危人群的腹泻患者进行艰难梭菌的检测,有利于病情的确诊和尽快采取有效的治疗。     

郴州市住院腹泻患者艰难梭菌感染状况及其基因特征

目的 通过对住院腹泻患者粪便中艰难梭菌的分离培养和毒力基因检测及分型,了解郴州市住院腹泻患者艰难梭菌感染状况。方法 收集2020年10-12月湘南学院附属医院、郴州市第一人民医院和郴州市第三人民医院住院腹泻患者粪便标本306例,厌氧培养法分离艰难梭菌菌株,采用荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测A、B毒素基因tcdA、tcdB及二元毒素基因cdtA、cdtB,并对分离的艰难梭菌菌株进行多位点序列分型(MLST)。结果 郴州市住院腹泻患者产毒艰难梭菌核酸阳性率为8.17%(25/306),>60岁患者感染风险更高(χ²=5.499,P=0.019); 306份标本中分离出17株艰难梭菌,粪便标本荧光PCR检测有25份阳性,二者比较有统计学差异(P=0.008),毒力基因检测均为tcdA⁺tcdB⁺,未检出二元毒素;选取7株艰难梭菌进行MLST分型,分出5个ST型,ST54型(3株)、ST129型(1株)、ST98型(1株)、ST53(1株)和ST631(1株)。结论 郴州市住院腹泻患者艰难梭菌感染率较低,感染毒素类型...     

学龄前患儿艰难梭菌毒素基因分型及患儿临床特点分析

目的探讨学龄前患儿艰难梭菌毒素基因分型及患儿临床特点。方法选取2017年10月—2020年10月在嘉兴市第二医院儿科住院的148例腹泻患儿为研究对象,所有患儿均留取48 h内粪便,将粪便标本置于-80℃冰箱中,进行艰难梭菌培养,实时荧光定量PCR完成DNA提取及毒素基因检测,酶联免疫吸附法测毒素A/B。结果148例腹泻患者的粪便标本培养出24株艰难梭菌,分离率16.21%。发现粪便标本培养阳性及培养阴性患儿近2个月抗生素使用情况、血红蛋白含量、白蛋白含量及粪便性状差异有统计学意义(P<0.05)。用PCR法对24株艰难梭菌毒素基因检测,tcdA和tcdB均为阳性菌株9株(37.50%),均为阴性3株(12.50%)。tcdA或tcdB阳性有12株(50.00%),其中tcdA^(-)tcdB^(+)菌株9株,tcdA^(+)tcdB^(-)菌株3株。酶联免疫吸附法检测,测得毒素阳性21例,阳性率为87.50%,其中毒素A^(+)B^(-)9例,毒素A^(+)B^(+)6例,毒素A^(-)B^(+)6例。建立logistic回归模型分析,抗生素过去2个月、白蛋白与粪便性状是艰难梭菌感染的危险因素(P<0.05)。结论艰难梭菌培养以产毒株tcdA^(-)tcdB^(+)、A^(+)B^(-)为主,艰难梭菌感染与抗生素过去2个月、白蛋白与粪便性状体有关,为艰难梭菌监测、预防具有指导价值。     

不同产毒类型艰难梭菌耐药性特征分析

目的通过研究临床艰难梭菌菌株的临床特征和耐药性,为临床防治艰难梭菌提供理论依据。方法收集2015年全年分离自临床的艰难梭菌,采用PCR技术检测其毒素基因,采用琼脂稀释法检测其耐药性,对患者的临床资料进行分析。结果共收集临床送检粪便标本144份,分离培养出艰难梭菌33株,艰难梭菌阳性检出率为22.92%;科室分布以神经外科、神经内科和消化科为主;分离所得到的艰难梭菌体外实验均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感,对红霉素和亚胺培南耐药检出株数最多,其次为克林霉素;33株艰难梭菌毒素基因检测结果 A+B+菌株24株,A-B+菌株1株;未检测到二元毒素基因cdtA和cdtB;产毒菌(25株)和非产毒菌(8株),两组菌株均对万古霉素、甲硝唑和替加环素敏感;非产毒艰难梭菌和产毒菌株对抗菌药物红霉素、亚胺培南、克林霉素、利福平和左氧氟沙星的耐药率比较,虽差异无统计学意义,但均高于产毒菌株;患者感染艰难梭菌后,均出现不同程度的腹泻,使患者病情加重,住院时间延长,并出现2例死亡病例。结论非产毒菌株对多种抗菌药物耐药率均高于产毒菌株,并出现对万古霉素敏感性降低的菌株,提示本地区艰难梭菌耐药性可能增加,甚至可能出现耐万古霉素的艰难梭菌。     

神经外科住院患者定植及感染产毒艰难梭菌的分子流行病学特征

目的 研究神经外科住院患者定植及感染产毒艰难梭菌的分子流行病学特征。方法 采用前瞻性研究方法,选取2018年11月-2019年4月所有徐州医科大学附属医院神经外科新入院的成年患者161例为研究对象。在入院后48 h内、入院后每周及发生腹泻时分别采集粪便标本,本研究的主要临床结局是发生艰难梭菌感染(CDI),未发生CDI的患者随访至出院或死亡。对采集的粪便标本进行艰难梭菌培养及毒素基因检测,对所有的产毒艰难梭菌进行多位点序列分型。结果 从41名患者的粪便中培养分离出产毒艰难梭菌共计50株,其中,30株菌株tcdA及tcdB阳性,占60.00%;17株菌株仅tcdB阳性,占34.00%;3株菌株tcdA、tcdB及cdtA-cdtB均阳性,占6.00%。7名患者发生CDI,CDI发病率为4.35%,其中6名患者在入院时定植产毒艰难梭菌。将分离的50株产毒艰难梭菌进行多位点序列分型,共分析出14个ST分型,其中3株二元毒素阳性菌株均为ST5型。研究期间,患者4与患者31、患者13与患者19检测到相同的ST型,且居住过同一病房或床位。结论 本研究未分离到高毒力菌株ST1/RT027型或ST11...     

昆明地区2018-2020年腹泻患者中艰难梭菌感染特征分析

目的对2018-2020年昆明地区腹泻患者中艰难梭菌感染特征进行分析, 为后续监测和防治提供数据支持。方法收集2018-2020年云南省4家哨点医院腹泻患者粪便标本共388份, 使用实时荧光定量PCR方法进行艰难梭菌粪便毒素基因检测, 对结果阳性的粪便标本进行菌株的分离, 用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定菌株。提取分离菌株的基因组DNA进行多位点序列分型(MLST)。分析毒素阳性和菌株分离阳性与患者的临床特征以及艰难梭菌阳性与其他病原共感染的情况。结果 388份粪便标本中, 艰难梭菌内参tpi基因阳性标本47份, 总阳性率为12.11%。其中, 非产毒艰难梭菌4份(8.51%), 产毒艰难梭菌43份(91.49%)。47份阳性标本分离得到18株艰难梭菌, 阳性标本的分离率为38.30%。其中tcdA、tcdB、tcdC、tcdR和tcdE基因均为阳性的菌株14株。18株艰难梭菌的二元毒素均为阴性。所有分离菌株的MLST结果共形成10种序列型(ST), 其中ST37型5株(27.78%);ST129、ST3、ST54和ST2型各2株;ST35、ST532、ST48、ST27和ST3...     

艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的临床应用价值探索

目的通过对艰难梭菌培养及毒素检测方法比较,建立艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的检测流程,评估其临床应用。方法收集2015年-2017年住院腹泻患者粪便标本852份,采用显色培养法(ChromID~(TM))培养艰难梭菌,阳性菌株用酶联免疫荧光法检测其毒素蛋白A/B(Clostridium difficile toxins A and B,CDAB);用酶联免疫荧光法检测毒素蛋白A/B及阳性菌株,用PCR方法检测其tcdA和(或)tcdB基因进行比较,运用检出率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值进行效能评价。结果 852例粪便标本经显色培养共分离菌108株,粪便直接酶法A/B毒素蛋白检出率为5.99%(51/852);阳性菌株联合酶法检测A/B毒素蛋白检出率为10.92%(93/852);108株阳性菌株联合PCR方法93株表达tcdA~+tcdB~+;6株表达tcdA~-tcdB~+;9株未表达,为tcdA~-tcdB~-;阳性菌株用酶法检测毒素蛋白A/B结果93株阳性,15株阴性,且93株阳性经PCR检测基因均表达tcdA~+tcdB~+;以PCR检测艰难梭菌毒素基因作为参考方法,培养阳性菌株联合酶法、粪便直接酶法检测毒素蛋白A/B的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为93.94%、100%、100%、60%和51.52%、100%、100%、15.79%;一致性检验Kappa值分别为0.721和0.150。结论显色培养后阳性菌株联合酶法检测艰难梭菌毒素蛋白A/B可以提高艰难梭菌检出率,与PCR毒素基因检测有较好一致性,操作简单,具有较好的临床应用价值。