Hedgehog信号通路与“肾虚血瘀”骨代谢失常的实验研究

目的观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠的骨组织和肾组织中Hedgehog信号通路细胞表面受体Patched-1(PTCH1)和Gli3mRNA和蛋白含量变化及补肾填精、活血化瘀中药复方对其影响,探讨中药组方治疗绝经后骨质疏松症的可行性以及绝经后骨质疏松症的发病机制与Hedgehog信号通路的关系。方法采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法建立绝经后骨质疏松症模型,分别给予补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、骨疏康对模型大鼠灌胃12周。然后将大鼠分为补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组、正常组和模型空白组,其中骨疏康作为阳性药物为阳性对照组。运用RT-PCR检测各组大鼠骨组织和肾组织PTCH1和Gli3mRNA相对表达量;通过ELISA法检测各组大鼠骨组织和肾组织PTCH1和Gli3蛋白含量。结果各组大鼠股骨和肾组织中PTCH1mRNA及蛋白表达方面:与正常组比较,模型组显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组显著降低(P0.01);各个用药组间比较,补肾填精组下调优于活血化瘀组,具有显著性差异(P0.01)。各组大鼠股骨和肾组织中Gli3mRNA及蛋白表达方面:与正常组比较,模型组显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾填精组、活血化瘀组、阳性对照组显著下降(P0.01);各个用药组间比较,补肾填精组下调优于活血化瘀组,具有显著性差异(P0.01)。结论 PTCH1mRNA及蛋白含量和Gli3mRNA及蛋白含量在去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织和肾组织中显著升高,提示PTCH1和Gli3可能参与绝经后骨质疏松症骨代谢失衡的发生和进展。补肾填精中药复方和活血化瘀中药复方可下调PTCH1和Gli3mRNA相对表达量及其蛋白含量,这可能是起到防治绝经后骨质疏松症的作用机制之一,并且补肾填精法优于活血化瘀法。     

中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨组织Hedgehog信号通路mRNA和蛋白表达的影响

目的观察去卵巢骨质疏松症大鼠模型骨组织Hedgehog信号通路中SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性变化,探究中药防治骨质疏松症病机的分子生物学机制。方法实验采用切除雌性SD大鼠双侧卵巢的方式建立骨质疏松症模型,运用补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方对模型大鼠进行干预12周,用骨疏康作为阳性药物对照组,以及正常组和模型组。ELISA法检测各组骨组织SHH、GLI1蛋白含量;RT-PCR检测各组SHH、GLI1 mRNA相对表达量。结果骨组织SHH、GLI1蛋白与正常组相比模型组含量明显减少(P0.01),与模型组相比较,各用药组均明显增加(P0.01)。结论骨质疏松症的发生机制与Hedgehog信号传导通路SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性下降有关;补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方通过激活Hedgehog信号传导通路中的SHH、GLI1,以促进骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨质疏松症的作用。     

补肾复方对去卵巢大鼠MEK1、ERK2基因表达的调控 作用

目的研究补肾中药复方(鹿茸、牡蛎、淫羊藿)对去卵巢骨质疏松症大鼠的影响,探讨肾虚骨质疏松症的病理机制,为中医药防治骨质疏松症提供实验依据。方法采用摘除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,以正常组作为标准对照,模型组作为空白对照,盖天力组作为阳性对照,补肾中药复方低、中、高剂量组作为实验组。各用药组灌胃给药12周。采用腹主动脉取血法采集大鼠血清测定血骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP),并用DEXA骨密度仪检测左侧股骨骨密度;右侧股骨匀浆提取骨组织中的Total RNA,RT-Real Time PCR,检测MEK1及ERK2的mRNA表达水平。结果模型组BGP水平显著低于正常组(P0.01),TRAP水平较正常组显著升高(P0.01);正常组和补肾中药复方组的股骨骨密度均高于模型组(P0.05);ERK2 mRNA相对表达量明显高于模型组(P0.01),MEK1mRNA相对表达量明显低于模型组(P0.01)。结论补肾中药复方具有防治去卵巢大鼠骨质疏松的作用,其机制与调控MEK1、ERK2基因表达有关。     

补肾、活血复方对骨质疏松症模型大鼠 VEGF 表达的影响

目的比较补肾、活血复方对骨质疏松症模型大鼠VEGF表达的影响,探讨补肾、活血复方治疗骨质疏松症的分子机制。方法以去卵巢骨质疏松症模型大鼠为实验研究对象,不同实验药物灌胃12周后,双能X线法测定骨密度,ELISA法测定骨、肾及血清中VEGF含量,定量PCR法测定骨、肾中VEGF mRNA相对表达量。结果骨质疏松症模型大鼠骨密度、VEGF蛋白及mRNA表达量显著降低,运用补肾、活血中药复方干预后,各组大鼠骨密度、VEGF蛋白含量及mRNA表达量显著升高。结论肾虚血瘀骨代谢失常与VEGF表达降低有关,补肾、活血复方通过调节VEGF表达水平,起到治疗骨质疏松症的作用。     

补肾益髓中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达的影响

目的观察去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达,探讨绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMOP)的发病机制以及补肾益髓中药复方的疗效机理。方法去卵巢复制骨质疏松症大鼠模型,实验设正常组、模型组、假手术组、补肾益髓中药复方组、钙尔奇D组、骨疏康组。术后7d开始灌胃给药12周。应用XR-36型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度,应用OLYMPUS BX51显微镜观察股骨头石蜡切片HE染色显微形态结构,实时定量RT-PCR及Western Blot检测骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达。结果 (1)与正常组、假手术组比较,模型组股骨骨密度明显降低(P0.001、P0.05),骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达明显降低(P0.001)。(2)与模型组比较,补肾益髓中药复方组、骨疏康组股骨骨密度明显升高(P0.05),补肾益髓中药复方组(P0.001)、钙尔奇D组(P0.05)、骨疏康组(P0.01)骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达明显上调。(3)与钙尔奇D组、骨疏康组比较,补肾益髓中药复方组骨组织Runx2 mRNA(P0.01、P0.05)及蛋白(P0.001)表达均明显升高。(4)股骨头石蜡切片HE染色显微形态结构:与正常组、假手术组比较,模型组骨小梁形态结构完整性差,有些部位破坏、断裂,余留骨重建空间较多;各给药组骨小梁形态结构均改善,结构较紧密,余留骨重建空间减少,其中以补肾益髓中药复方组改善最明显。结论骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达降低可能是PMOP的发病机制之一;补肾益髓中药复方可能通过上调骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达有效防治PMOP,其作用优于钙尔奇D、骨疏康。     

补肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1信号转导蛋白表达影响的实验研究

目的 通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1 的表达变化,探索骨质疏松症的发病机理.方法 实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用补肾填精作用的纳米钙补肾填精中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;免疫组化SABC法检测股骨中的Smurf1 蛋白活性表达.结果 与正常组相比较,模空组Smurf1 阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01.结论 骨组织中Smurf1阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smurf1的表达,而起到防治骨质疏松症的作用.     

补肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1信号转导蛋白表达影响的实验研究

目的 通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1 的表达变化,探索骨质疏松症的发病机理.方法 实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用补肾填精作用的纳米钙补肾填精中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;免疫组化SABC法检测股骨中的Smurf1 蛋白活性表达.结果 与正常组相比较,模空组Smurf1 阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01.结论 骨组织中Smurf1阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smurf1的表达,而起到防治骨质疏松症的作用.     

补肾益髓中药对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨组织Runx2的mRNA及蛋白表达的影响

目的 观察糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)大鼠模型骨组织Runt相关基因2(Runx2)mRNA及蛋白表达,探讨GIOP的发病机制以及补肾益髓中药的疗效及其调控作用.方法 采用后肢肌注地塞米松(2.5 mg/kg,每周2次,连续9w)的方法复制GIOP大鼠模型,按体重分层随机分为正常组、模型空白组、补肾益髓中药组、补中益气颗粒组、血府逐瘀胶囊组、骨疏康颗粒阳性对照组.灌胃给药9w.应用XR-26型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度,以评价动物模型的成立及药物疗效.实时定量RT-PCR(Real-Time Quantitative RT-PCR)检测骨组织Runx2 mRNA表达,Western blot检测骨组织Runx2蛋白表达.结果 (1)股骨骨密度:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾益髓中药组明显升高(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组明显升高(P<0.05),补中益气颗粒组和血府逐瘀胶囊组虽有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05).(2)骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾益髓中药组明显上调(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组也有明显上调(P<0.05),补中益气颗粒组和血府逐瘀胶囊组虽有所升高,但无统计学意义(P>0.05).结论 (1)肌注地塞米松可以成功复制GIOP大鼠模型,(2)骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达水平降低可能是GIOP的发病机制之一,(3)应用补肾益髓中药具有明显防治效果,疗效优于健脾中药和活血中药,其作用机理与上调骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达密切相关.     

中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP)含量影响的比较研究

目的观察补肾、健脾、活血法对骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)含量变化的影响。方法将SD雌性大鼠分为正常组、模型组、补肾组、健脾组、活血组。采用酶联免疫法测定小鼠骨骼、骨骼肌PTHrP含量变化。结果(1)与正常组比较,模型组大鼠骨骼的PTHrP含量显著降低(P0.01);与模型组比较,补肾组、健脾组、活血组骨骼的PTHrP含量明显升高(P0.01),其中补肾组升高程度比较明显。(2)与正常组比较,模型组大鼠骨骼肌的PTHrP含量显著降低(P0.01);与模型组比较,补肾组、健脾组、活血组骨骼肌的PTHrP含量明显升高(P0.01),其中健脾组升高程度比较明显。结论 (1)骨质疏松症的形成,可能与骨骼、骨骼肌协调性下降有关。(2)补肾、健脾方法通过提高骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌PTHrP含量,对骨质疏松症具有一定的防治作用。     

益肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠的骨组织中Smad1/5的表达影响

目的 通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smad1/5在细胞中的表达,探索肾虚骨质疏松症的发病机理.方法 实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用益肾填精作用的纳米钙补肾中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;应用双能X线骨密度仪检测离体股骨的骨密度;HE染色光镜下观察股骨形态;免疫组化SABC法检测股骨中的Smad1/5蛋白活性表达.结果 与正常组比较,模空组大鼠股骨头的骨密度显著降低,P<0.01;与模空组比较,用药12周之后各用药组均可提高模型大鼠股骨的骨密度值;HE染色光镜下观察各组大鼠右侧股骨头病理切片,模空组骨髓腔增大,骨小梁断裂,各用药组可见骨髓腔较小,形态结构较完整;与正常组相比较,模空组Smad1/5阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01.结论 骨组织中Smad1/5阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,纳米钙补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smad1/5的表达,而起到防治肾虚骨质疏松症的作用.     

基于Wnt信号通路探讨补肾益气活血中药复方对去卵巢大鼠骨质疏松症的作用机制

目的观察去卵巢大鼠骨质疏松症模型骨、肾组织中Wnt3a信号蛋白的变化,探究补肾益气活血中药复方对骨质疏松症作用的分子生物学机制。方法将雌性大鼠75只随机分为5组:正常组、模型组、福善美组、补肾益气活血方低剂量组、补肾益气活血方高剂量组,后4组摘除大鼠双侧卵巢法复制骨质疏松症模型,连续给药12周后以双能X线检测骨密度,ELISA法检测血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)以及骨、肾组织中Wnt3a蛋白表达。结果与正常组比较,模型组骨密度明显降低,血清ALP明显减少,血清TRAP明显升高,骨及肾组织中Wnt3a蛋白表达明显减少;与模型组相比较,各治疗组骨密度、血清ALP及骨、肾组织Wnt3a蛋白均有不同程度的升高。结论骨质疏松症的发生机制与Wnt3a蛋白变化有关;补肾益气活血中药复方的疗效作用机制是通过调节和改善Wnt3a蛋白的表达,激活Wnt3a/β-catenin信号传导通路,促成骨分化,抑制破骨细胞,起到防治骨质疏松症的作用。     

中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌SDF-1含量影响的比较研究

目的探究用中医滋补肾阴、温补肾阳、健脾、补肾健脾治法治疗绝经后骨质疏松症是否会引起骨骼、骨骼肌中SDF-1水平的变化,从而扩展中医防治骨质疏松症的现代医学机制。方法除正常组外,将去卵巢致骨质疏松症的大鼠随机分为模型组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组和福善美组。采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清ALP、TRACP及骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平。结果模型组大鼠血清ALP和TRACP水平均比正常组显著升高(P<0.01);各治疗组均比模型组显著降低(P<0.01),以福善美组降低最为明显,其次为补肾健脾组。②模型组大鼠的骨骼和骨骼肌SDF-1水平均比正常组显著升高(P<0.01);与模型组相比,补肾阳组、福善美组大鼠骨组织SDF-1水平显著降低(P<0.01),健脾组、补肾阴组也降低(P<0.05),福善美组、健脾组大鼠的骨骼肌SDF-1水平显著降低(P<0.01)。结论骨质疏松症的发生与骨骼、骨骼肌中SDF-1水平的升高有关。②补肾阴、补肾阳、健脾和补肾健脾法可以减少绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平,从而对骨质疏松症起到一定的防治作用。     

四种中药复方对糖尿病肾病大鼠肾脏组织中Ang-1、Ang-2、Tie-2和VEGF mRNA表达影响

目的：观察四种中药复方对糖尿病大鼠肾脏的肾脏血管生成素、Tie-2和VEGF表达的影响。方法：取链脲霉素诱导SD大鼠DN模型72只,分为模型对照组、益气养阴方组、滋补肝肾方组、补气养血方组、温肾健脾方组和阳性对照组,每组12只;另取12只大鼠为正常对照组。连续经口灌胃给药8周后,收集尿液测定U-TP、U-GLU和U-β2微球蛋白生化指标,用RT-PCR测定肾脏组织中Tie-2、VEGF mRNA的表达。结果：益气养阴方、滋补肝肾方、补气养血方、温肾健脾方均能显著降低Ang-1mRNA表达（P〈0.05,P〈0.01）;益气养阴方组大鼠肾脏Ang-2和Tie2 mRNA表达显著降低（P〈0.05,P〈0.01）;给予补气养血方和温肾健脾方后,大鼠的肾脏Ang-2 mRNA表达显著降低（P〈0.01）。结论：四种中药复方均能有效降低Ang-1、Ang-2和VEGF mRNA的表达;参芪地黄汤还可降低Tie-2 mRNA的表达,表明四种复方可通过抑制血管重建作用而治疗大鼠糖尿病肾病,其中参芪地黄汤效果较佳。     

补血活血法治疗骨质疏松症中“血虚、血瘀”的研究进展

既往防治骨质疏松症多以“肾主骨”为基本思想,但近年来通过流行病学、体外实验、临床调查等发现骨质疏松症与血虚、血瘀密不可分,是骨质疏松症中重要的致病因素。笔者通过整理近年来相关研究,通过历代医家经验、微观机制研究和中医药防治策略探讨血虚、血瘀对骨质疏松症的影响及补血活血法在骨质疏松症中的应用。多项研究证明补血活血法具有确切的物质基础和相应的微观调控机制来调节相关蛋白、信号通路并发挥雌激素样作用防治骨质疏松症,且能改善患者血虚、血瘀状态。故该文以补血活血法为基础探讨防治骨质疏松症的思路与方法。     

实验性骨质疏松大鼠骨组织内Ⅰ型胶原mRNA的表达水平

目的 为了探讨在骨质疏松发生过程中骨合成的改变,检测去势大鼠骨组织Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的表达水平。方法 切除ＳＤ大鼠双侧卵巢,复制骨质疏松动物模型,从骨组织内提取ＲＮＡ,以地高辛标记的点杂交方法检测去势和对照组Ⅰ型胶原ｍＲＢＡ的表达。结果 去势大鼠骨组织Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的滴度较对照组明显降低。结论骨质疏松发生过程中有风Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ表达的下降,提示骨质疏松不仅涉及骨吸收,还有骨合成的降低。     

橙皮苷对去卵巢骨质疏松症大鼠骨质流失和机制的影响

目的研究橙皮苷对去卵巢骨质疏松大鼠骨质流失和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子kappa B配体的受体激活物(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)/RANK通路的影响。方法将48只雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组、去卵巢骨质疏松组、橙皮苷低剂量组、橙皮苷中剂量、橙皮苷高剂量组和雌激素组。检测骨组织骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp),通过HE染色观察骨组织病理损伤,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测人Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal peptide collagen typeⅠ,CTX-Ⅰ)和血清骨钙素(bone glaprotein,BGP)的表达量。运用qRT-PCR和Western bolt分别检测骨组织OPG、RANKL、RANK的mRNA和蛋白表达。结果在橙皮苷治疗后,与去卵巢骨质疏松组相比,骨质疏松标志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高,Tb.Sp水平降低;大鼠骨小梁数量明显增加,且骨小梁连接更为紧密;骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平降低;骨形成标志物BGP水平升高。OPG mRNA相对表达量和蛋白的表达量升高,RANKL和RANK mRNA相对表达量和蛋白的表达量降低。结论橙皮苷能缓解去卵巢骨质疏松大鼠骨质流失并调节OPG/RANKL/RANK信号通路。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中CXCR4蛋白表达的研究

目的 探究中医补肾阴、补肾阳、健脾、补肾健脾不同治法对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中CXCR4蛋白表达的影响,从而为中药防治骨质疏松症提供依据。方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将SPF雌性SD大鼠用随机数字表法随机分成6组,依次分别为：正常组、诱导液组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,各组成骨诱导18 d后,进行茜素红染色检测矿化情况,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上述每组细胞上清液CXCR4、BMP2蛋白表达水平。结果 诱导18 d后,与正常组相比,补肾阳组与补肾健脾组BMP-2含量均显著升高(P<0.01),诱导组、补肾阴组BMP-2含量有所升高,但差异不具有统计学意义(P>0.05);与诱导组相比,补肾健脾组BMP-2含量均显著升高(P<0.01),补肾阴组与补肾阳组BMP-2含量有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05),各含药组BMP-2蛋白浓度比较依次为：补肾健脾组>补肾阳组>补肾阴组>健脾组;与正常组相比,各组CXCR4含量均显著升高(P<0.01),且补肾健脾组上...