铁调素对成骨细胞骨相关基因表达的影响

目的研究铁调素对人成骨细胞(hFOB1.19)Ⅰ型胶原(COL1)、骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)基因表达的影响。方法成骨细胞在34℃下进行体外培养,以不同浓度铁调素(50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L)干预72 h后,收集细胞,分别抽取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中COL1、OPG、BGP mRNA表达的变化。结果 RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后,各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表达;不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义(P0.05),但铁调素在400 nmol/L时抑制OPG的表达(P0.05)。结论 铁调素可上调成骨细胞(hFOB1.19)COL1、OPG、BGP mRNA表达,铁调素浓度增加转录水平逐渐增加,显示有浓度依赖性。     

铁调素干预成骨细胞(hFOB1.19)后细胞膜转铁蛋白1、铁离子、矿化及成骨基因变化研究

目的 探讨铁调素对成骨细胞铁代谢指标、骨代谢指标的影响和相互关系。方法 成骨细胞 （hFOB1.19）培养3d后,使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨细胞（hFOB1.19）的膜转铁蛋白1 （ferroportin1,Fpn1）的表达;再用不同浓度的铁调素（25noml/L,50noml/L,100noml/L）干预培养 环境,对照组加相同体积双蒸水,干预20h,MTT法检测细胞增殖情况;激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）检 测成骨细胞内铁离子荧光染色后荧光强度变化情况;Von Kossa染色检测成骨细胞矿化情况;RT-PCR检测 骨钙素（BGP）、I型胶原（COL1）、骨保护素（OPG）基因表达。结果 1、成骨细胞存在Fpn1表达;2、铁 调素对成骨细胞增殖无显著影响（P>0.05）;3、铁调素干预后,成骨细胞内铁离子含量增多,且与铁调 素干预存剂量依赖性关系（P<0.05）;4、铁调素干预后,成骨细胞矿化功能增强,且与铁调素干预存剂 量依赖性关系（P<0.05）;5、RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后,各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表 达;不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义 （P<0.05）,但铁调素在400nmol/L时抑制OPG的表达（P<0.05）。结论 成骨细胞存在铁调素作用的膜转 铁蛋白-1,所以铁调素干预成骨细胞培养环境后细胞内铁离子发生特异性变化,同时细胞矿化指标显著增 加、细胞COL1、OPG、BGP mRNA表达含量增加;研究提示：铁调素可能通过膜转铁蛋白影响成骨细胞铁离 子变化,细胞铁代谢变化可能引起细胞成骨指标上调改变。     

黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

目的观察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins,CSS)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响,以及与骨质疏松相关的SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路的作用。方法通过MTT实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSS对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平; Western blot检测SPARC、OPG/RANKL的蛋白表达量。结果与阳性对照组相比,CSS能明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05),CSS高、中剂量组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性及钙化结节数量(P0.05);与空白组相比,CSS不同剂量组均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。结论黄瓜籽总皂苷能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

痩素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的初步探讨瘦素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖及骨保护蛋白、核因子κB激活受体配体mRNA表达的影响。方法以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,用MTT法检测瘦素作用MC3T3-E1细胞后的增殖情况,RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA表达。结果瘦素（10、20、40、80和160ng.mL-1）作用于MC3T3-E1细胞24h后,可促进其增殖,OD值显著增加（P〈0.01）,增加骨保护蛋白mRNA表达,同时降低核因子κB激活受体配体mRNA表达,且呈浓度依赖性。结论瘦素促进MC3T3-E1细胞增殖,同时通过调节骨保护蛋白mRNA和核因子κB激活受体配体mRNA的表达,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

蓇密钙片与马鹿角多肽对成骨细胞增殖分化的研究

目的观察蓇密钙片及马鹿角多肽对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1的增殖分化作用及细胞内OPG、RANKL mRNA的表达。方法采用MEM(10%FBS)培养液培养细胞,细胞计数法描绘成骨细胞生长曲线;MTT法检测蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用;蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组干预鼠胚成骨细胞MC3T3-E1 72 h后,比色法检测细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量,RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子КB激活受体配体(receptor activator of NK-КB ligand,RANKL)mRNA的表达。结果蓇密钙片及马鹿角多肽作用于MC3T3-E1成骨细胞72 h后,可促进其增殖,OD值增加(P0.05),增加ALP的含量,促进OPG mRNA表达,同时抑制RANKL mRNA表达。结论蓇密钙片及马鹿角多肽促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化,可能与促进成骨细胞OPG mRNA表达、抑制RANKL mRNA表达有关,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。     

组蛋白甲基转移酶2（SMYD2）抑制剂LLY-507对成骨分化的影响

目的 研究SMYD2抑制剂LLY-507对小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1）及人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的影响。方法 通过CCK-8法检测LLY-507对MC3T3-E1和hMSCs增殖的影响;采用碱性磷酸酶( ALP) 染色和活性测定检测不同浓度LLY-507干预下MC3T3-E1和hMSCs早期成骨分化标志物ALP的活性情况;通过茜素红染色及半定量分析检测LLY-507对MC3T3-E1和hMSCs矿化能力的影响;运用荧光定量PCR检测hMSCs的成骨相关基因Osterix、Runx2、OPG、OPN mRNA的表达;Western blot检测hMSCs的Runx2和SMYD2蛋白表达量。结果 CCK-8结果表明LLY-507在0.8 μmol/L的剂量下细胞活性无明显影响,不会明显抑制细胞增殖。ALP染色及活性测定表明,加入50 nmol/L及以上剂量的LLY-507干预7 d后能够明显抑制MC3T3-E1及hMSCs成骨分化以及碱性磷酸酶的表达（P<0.05）;茜素红染色及半定量分析表明100 nmol/L剂量的LLY-507能够明显抑制MC3T3-E1及hMSCs的矿化能力（P<0.05）。通过qPCR,加入25 nmol/L及以上剂量的LLY-507分别干预7 d和14 d后能够明显抑制hMSCs成骨分化相关基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表达（P<0.05）。通过Western blot, 加入50 nmol/L及以上剂量的LLY-507干预7 d和14 d后均能够明显抑制hMSCs的Runx2蛋白和SMYD2蛋白的表达。结论 抑制SMYD2的表达能够抑制成骨相关基因的表达,说明SMYD2在成骨分化过程中起到促进成骨的作用。     

淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究

目的检测淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞MC3T3-E1中Smad4mRNA的影响。方法用0、10、20、40ng/ml的淫羊藿甙刺激MC3T3-E1细胞。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。通过四甲基噻唑蓝(MTT)法测绘细胞生长曲线和计算细胞群体倍增时间;描述刺激MC3T3-E1细胞的增殖能力。用速率分光光度法测定ALP的含量,免疫组织化学法观察Ⅰ型胶原的产生,用以判断细胞的分化情况。用RT-PCR测定Smad4mRNA的数量。结果10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可使MC3T3-E1细胞的生长曲线明显上移(P<0.01);0、10、20和40ng/ml组群体倍增时间分别为(39.37±2.35)h、(26.76±1.78)h、(29.30±2.12)h和(36.35±2.34)h,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01);0、10ng/ml可使MC3T3-E1细胞产生ALP和Ⅰ型胶原量增加,刺激ALP作用呈现时间和剂量的依赖性(P<0.01);RT-PCR显示10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可以刺激MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的数量增加。上述作用以10ng/ml浓度最强(P<0.01)。结论淫羊藿甙刺激成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化,可能是通过提高MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的量而产生作用。     

流体剪切力对MC3T3-E1细胞OPG、RANKL蛋白表达的实验研究

目的探讨流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下,两种调节骨骼重建的重要分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的蛋白表达情况。方法采用体外模型对MC3T3-E1细胞加载流体剪切力,细胞经不同时间加力后(0,30,60,90,120min),对细胞分别进行染色和裂解,运用免疫荧光和蛋白印迹法对OPG和RANKL的蛋白表达水平进行定量分析。结果 FSS作用30,60,90,120min后能够显著增加OPG的蛋白表达(P0.05),减少RANKL的蛋白表达(P0.05)。两者共同作用使得OPG/RANKL值显著增高(P0.05)。结论流体剪切力刺激提示OPG/RANKL的比值可能在成骨细胞和破骨细胞联合调节骨骼形成和吸收的过程中起着重要的调节作用。     

不同大小机械牵张力对MC3T3-E1成骨样细胞MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的影响

目的:研究不同大小的机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1mRNA表达的影响。方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加6%、12%和18%的机械牵张力,作用24h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1mRNA表达的变化。结果:细胞受力后,其MMP-13/TIMP-1mRNA表达随牵张力值的增大明显增加。结论:不同大小的机械牵张力可以影响成骨细胞的MMP-13/TIMP-1mRNA表达,进而影响骨改建。     

淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1,5作用的实验研究

目的 检测淫羊藿甙(icariin,ICA)对MC3T3-EI中Smad1,5 mRNA及蛋白的影响.方法 DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10、40及80 ng/ml分为四组,各组接种于6孔板中,接种细胞数目约为3×105个/孔,分别于给药后24、48及72 h,用半定量RT-PCR技术测定Smad1,5 mRNA的量,以Western blot评价Smad1,5蛋白的量.并于给药72h后用免疫组织化学定位Smad1,5蛋白的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学分析.结果 RT-PCR显示ICA刺激24 h后,0、10、40、80 ng/ml各组Smad1.5 mRNA量的表达无统计学差异;刺激48 h后,0 ng/ml组Smad1mRNA表达量检出极少,Smad5 mRNA未检出;至72 h时,0 ng/ml组二者均未检出,而10、40、80 ng/ml各组在刺激48、72 h时,Smad1,5 mRNA保持较高水平,各组Smad1,5 mRNA的表达量较0 ng/ml组具有统计学意义.Westem blot蛋白印迹显示10、40、80 ng/ml各组的Smad1蛋白表达于不同时间点较0ng/ml组明显增加,0 ng/ml组仅于刺激72 h后少量检出.Smad5蛋白表达除0 ng/ml组外,于10、40、80ng/ml各组在不同时间点均有检出,较0 ng/ml组具有统计学意义.免疫组织化学显示10、40、80 ng/ml组,于胞质及核内Smad1,5蛋白的表达较0 ng/m组均增多.结论 淫羊藿甙可能通过上调Smad1,5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化.     

淫羊藿甙促进成骨细胞增殖与分化的作用及其机制

 目的 探讨淫羊藿甙对骨形态发生蛋白细胞信号通路Smad1、Smad5和Smad4表达的调节作用及促进成骨细胞增殖与分化的机制。方法 在体外分别用含淫羊藿甙0、10^-9、10^-8 和10^-7 mol/L的条件培养液干预MC3T3-E1细胞。给药后第1天、2天和3天,分别应用四甲基噻唑蓝法绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,用速率分光光度法测定碱性磷酸酶含量,用RT-PCR和Western blot技术检测Smad1、Smad5、Smad4及骨钙素、Runx2、骨形态发生蛋白-2、骨保护素mRNA的表达,于细胞生长的第21天观察钙结节数量。结果 淫羊藿甙含量为10-8 mol/L时,MC3T3-E1细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性和钙结节数量明显增加;淫羊藿甙作用细胞第1天、2天和3天时,10-8 mol/L组细胞Smad1、Smad5和Smad4 mRNA的表达量始终保持较高水平,第3天时10^-9 mol/L和10^-7 mol/L组表达明显减少;第2天时,10^-8 mol/L组细胞Runx2、骨形态发生蛋白-2、骨保护素mRNA和骨钙素、Smad1、Smad5和Smad4蛋白表达明显增加。结论 淫羊藿甙通过直接刺激 MC3T3-E1细胞的骨形态发生蛋白-2、Runx2、Smad1、Smad5和Smad4的表达,且以表达水平同步增高的方式促进其成骨性分化。     

黄芩素通过BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨作用的实验研究

目的 探讨黄芩素（BAI）对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）成骨分化的作用及其分子机制。方法 将MC3T3-E1分为对照组（正常培养）和BAI组（以Baicalein处理）,在成骨分化条件培养下采用CCK-8检测BAI对MC3T3-E1细胞增殖的影响;分别以碱性磷酸酶染色（ALP）、茜素红染色（ARS）检测MC3T3-E1细胞成骨分化水平与矿化能力,实时荧光定量PCR检测成骨标志基因ALP、COL1A1、RUNX2、OSX的mRNA表达水平,通过免疫印迹法（Western-blot）检测MC3T3-E1细胞中BMP-2、Smad1、p-Smad1蛋白表达水平,通过免疫荧光技术（IF）检测RUNX2、COL1A1表达水平。结果 与对照组比较,BAI干预1 d后发现,BAI组COL1A1（P<0.001）、RUNX2（P <0.05）、OSX（P <0.05） mRNA表达水平在成骨分化中表达上升;干预3 d后发现,与对照组比较,BAI组ALP（P <0.05）、RUNX2（P <0.001）mRNA表达上升;干预7 d后发现,与对照组比较,BAI组COL1A1（P <0.05）mRNA表达水平较对照组上升,BMP-2、p-Smad1/Smad1蛋白表达水平上升（P <0.05）。免疫荧光中成骨标志蛋白RUNX2、COL1A1表达增多（P <0.05）。结论 BAI可通过激活BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨分化。     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

二甲双胍调控PI3K/Akt/mTOR通路减轻糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

目的探讨二甲双胍(Met)调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路对糖皮质激素地塞米松(Dex)诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法将体外培养的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分为对照组(正常培养)、Dex组(以Dex处理)、Met组(以Dex和Met共同处理)、Met+IGF-1组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路活化剂IGF-1共同处理)、Met+NVP-BEZ235组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路抑制剂NVP-BEZ235共同处理),采用免疫印迹法(WB)检测MC3T3-E1细胞中PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt、m TOR和p-mTOR蛋白表达水平,通过噻唑蓝(MTT)法检测MC3T3-E1细胞存活率、流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡率、实时荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性测定试剂盒检测MC3T3-E1细胞Caspase-3活性、JC-1探针检测MC3T3-E1细胞线粒体膜电位变化。结果与对照组比较,Dex组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显降低,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平和Caspase-3活性均明显升高(P0.05);与Dex组比较,Met组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显升高,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性明显降低(P0.05);给予IGF-1作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显增强,而给予NVP-BEZ235作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显减弱(P0.05)。结论 Met可通过激活PI3K/Akt/m TOR通路抑制线粒体凋亡途径,减轻糖皮质激素Dex诱导的成骨细胞凋亡。     

抑制核纤层蛋白A/C表达对牵张刺激下成骨细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制核纤层蛋白A/C(lamin A/C)表达对牵张刺激下小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖及凋亡的影响.方法 化学合成3条针对lamin A/C靶点的siRNA序列,脂质体转染MC3T3-E1细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测lamin A/C mRNA和蛋白变化.细胞转染72 h后行牵张刺激6 h,Hoechst 33258检测DNA含量来反映细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡.结果 筛选出的siRNA-2显著抑制lamin A/C mRNA和蛋白产物表达(P＜0.01).未转染细胞经牵张刺激,DNA合成随时间推移而增加;细胞G0/G1期比例为65.19%;S期为22.57%,细胞凋亡率为11.49%;转染细胞经牵张刺激后,DNA合成较未转染细胞显著性减少(P＜0.01);G0/G1期比例提高至85.82%;S期降低至11.37%,凋亡率达19.32%(P＜0.01).结论 抑制lamin A/C表达会导致牵张刺激诱导的促增殖作用减弱,细胞周期阻滞于G0/G1期,促进细胞的凋亡.