结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达，纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白，研究其特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白，通过Western blotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原，通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pE T15b-MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外，其余密码子均与报道的相同，但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21（DE3）细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的20－30％，分子量约26kDa,Western blotting分析它与抗结核分要支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS－PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值，PDD的特异性和敏感性分别为 94％（31／33）、63.7%(21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94%(31/33)、30.3(10/33)；一步法分别为88％（29／33）。结论 pET15b－MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表表重组 MPT64蛋白，该蛋白具有较高的抗性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

目的 表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础。方法 分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化E.coil BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物。镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体。以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性。结果 成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23 kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP。制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1∶102 400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应。对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1 nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性。结论 成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys³³和Arg³⁹是LMW-PTP的活性位点。为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础。     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定

目的 通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法 采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果 表达、纯化了45 ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论 成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

结核分枝杆菌rHpsX-MPT64融合蛋白的制备与临床应用

目的 构建结核分枝杆菌融合基因hpsX-mpt64原核表达系统,建立基于rHpsX-MPT64为包被抗原酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)并对其用于结核患者血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法 PCR扩增并克隆结核分枝杆菌hpsX和mpt64基因,以连接引物PCR构建hpsX-mpt64人工融合基因,建立上述目的基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白,Western Blot检测其免疫性。分别以rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原,建立相应ELISA检测150例健康人群、73例非结核肺部疾病患者和277例活动性肺结核患者血清标本中抗体。结果 克隆的hpsX和mpt64及构建的hpsX-mpt64融合基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达量分别为细菌总蛋白的20.3%、28.5%和26.5%,其提纯物电泳后均显示单一条带。基于rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA对涂阳患者血清抗体检出率明显高于涂阴患者(P<0.01),检测活动性结核患者血清抗体的敏感性分别为59.2%、61.4%和74.4%,特异性分别为90.6%、83.9%和91.0%,rHpsX-MPT64为包被抗原敏感性明显高于rHpsX和rMPT64抗原(P<0.01)。结论 基于rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA有较高的敏感性和特异性,重组融合蛋白为抗原有助于进一步提高检测结核病血清学诊断的敏感性。     

结核分枝杆菌组合蛋白的表达及血清学诊断价值的评价

目的取得能用于结核病血清学诊断的敏感性、高特异性强的组合蛋白。方法用DNA双链全合成的方法合成ESAT6,MPT64,38KD,Ag85B等结核分枝杆菌特异性抗原的抗原表位基因,用PCR法将这些基因片段连接起来成为新型抗原的编码基因。将该编码基因克隆于pET24b载体,经测序鉴定后转化于大肠杆菌BL21菌株用IPTG进行诱导表达。组合蛋白经镍柱纯化后用Western印迹法和酶联免疫实验（ELISA）对其抗原性和特异性进行检测。结果携带重组质粒的菌株经IPTG诱导后以包涵体的形式大量表达组合蛋白,经镍柱纯化后蛋白质浓度达到0．5mg／ml,western实验表明：该组合蛋白能与结核病人血清特异性结合,而不与健康人血清结合。以该组合蛋白为包被抗原采用ELISA法检测结核抗体的灵敏度为61％,特异性为97．3％。PPD检测的灵敏度和特异性分别为73．7％和91．8％。该组合蛋白检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为2．1％,特异性为97．9％,而PPD检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为22．3％,特异性为79．7％。结论该组合蛋白用于结核病血清学诊断具有较高的灵敏度和特异性,能够为结核病的临床诊断提供一定的指导。     

牛结核病鉴别诊断的方法研究

目的构建含结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)tb10.4基因片断的原核表达载体,在E.coli中诱导表达带组氨酸标记的该融合蛋白。分别以TB10.4蛋白,PPD蛋白以及TB10.4与MPT83混合蛋白为抗原,用间接ELISA法鉴别牛结核病。方法PCR法扩增tb10.4基因片段,连接到pET-22b(+)原核表达载体中,将重组子转化到大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株BL21(DE3)/PolysS,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化。之后将TB10.4,PPD,TB10.4及MPT83混合蛋白作为抗原用间接ELISA法检测牛结核病。结果使用结核杆菌早期分泌蛋白TB10.4作为抗原用间接ELISA方法快速检测牛结核病,并区分BCG免疫的健康牛和感染牛的结果显示灵敏度为23%,没有假阳性反应。结论用PPD作为抗原进行检测灵敏度达到48%,但假阳性率达到21%;用TB10.4与MPT83混合抗原检测时灵敏度下降到6%,假阳性率1%。     

结核分支杆菌16000抗原基因在大肠杆菌中的高效表达及 …

目的 获得高效表达结核分支杆菌１６０００抗原的大肠杆菌工程菌,将培养物纯化后得到重组１６０００蛋白抗原纯品,并检测其免疫学特性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ）分析重组蛋白抗原的相对分子质量大小及表达形式。ＤＥＡＥ及ＰＥＩ凝胶纯化重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹及酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）分析重组蛋白的免疫原性。结果 构     

四种结核抗原的诊断效能分析与建立结核抗原诊断效能的评价体系

目的通过对4种结核分枝杆菌抗原的诊断效能分析,初步建立其诊断效能评价体系,为结核病免疫学诊断筛选特异、有效抗原提供根据。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和受试者工作特征曲线法(Receiver Operating Characteristic,ROC)建立结核抗原诊断效能评价体系。然后,对4种重组结核抗原的诊断效能进行分析,得出各种抗原组合的检测阳性率,进而评价得出最佳的抗原组合方式。结果该结核抗原诊断效能的评价体系包括最佳ELISA反应体系、ROC曲线的建立、确定各种抗原最佳临界值(Cut-off value)、最佳抗原组合方式的确定。ELISA检测体系的中CFP10、38kDa、MPT64和Ag85B的最佳蛋白包被浓度分别为0.5μg/mL、2μg/mL、2μg/mL和1μg/mL,最佳血清稀释度分别为1∶250、1∶225、1∶225和1∶225;对这4种结核抗原及其不同组合的ELISA检测诊断效能进行了评价,以组合抗原的诊断效能较好,最佳组合为38kDa+CFP10+MPT64,阳性率为64.7%。结论成功建立了结核抗原诊断效能评价体系。结果显示ELISA检测中以多组分抗原组合为宜。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核分枝杆菌38 ku蛋白的制备及其抗原性研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌38ku蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法2003年2月至2004年3月在中国药品生物制品检定所菌苗室以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应(PCR)方法对38ku蛋白基因进行扩增,以PET-30a( )为载体构建重组质粒,在大肠埃希菌中表达38ku蛋白,通过金属离子螯合亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分析该重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的38ku蛋白重组质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,经过一步金属离子螯合亲和层析后得到纯度为92.7%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感度和特异度分别为80.5%(33/41)和96.0%(25/26)。结论大肠埃希菌工程菌以包涵体的形式表达38ku蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。