外源性Apelin调节自噬对防治大鼠肺动脉高压形成的作用

  目的  从细胞自噬的角度,探讨外源性Apelin对肺动脉高压(PAH）的作用及相关机制。  方法  26只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=6）、模型组（n=10）和干预组（n=10）,模型组和干预组采用左肺切除术联合野百合碱注射法（PE+MCT）制备大鼠PAH模型,对照组仅打开胸腔+注射等量生理盐水。从术后第2周开始,干预组每日按大鼠体质量腹腔注射10 nmol/kg Apelin-13,连续3周,对照组与模型组均注射等量生理盐水。3组大鼠均于术后第5周测量平均肺动脉压力（mPAP）,计算右心室肥厚指数（RVHI）,行HE染色观察肺组织及肺血管形态结构,肺组织免疫荧光染色检测自噬相关蛋白LC3的表达,实时荧光定量（qRT）-PCR测量肺组织自噬相关蛋白P62、Beclin-1的mRNA表达量,Western blot测量肺组织LC3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Beclin-1的蛋白表达量,肺组织免疫荧光染色检测自噬相关蛋白LC3的定位及表达。  结果  与对照组相比,模型组mPAP、RVHI升高（P<0.05）,肺组织结构紊乱、肺血管壁增厚,肺组织LC3蛋白表达量升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高,Beclin-1的mRNA和蛋白表达量升高,P62的mRNA和蛋白表达量下降（P<0.05）;Apelin-13干预后,上述指标均得到改善（P<0.05,与模型组比较）。  结论  外源性Apelin对PAH的形成具有一定的防治作用,其作用机制可能与Apelin抑制自噬有关。     

BQ-123 对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能的保护作用研究

目的 探讨BQ-123 对蛛网膜下腔出血（SAH）的治疗作用及其机制。方法 160 只雄性SD 大鼠,随机分为假手术（Sham）组、SAH 组、雷帕霉素组、低剂量BQ-123 组、高剂量BQ-123 组。2 次 注血法复制SAH 大鼠模型;光镜观察海马区形态结构变化;免疫组织化学法检测海马区雷帕霉素靶蛋白 （mTOR）、自噬相关基因Beclin-1 和微管相关蛋白1 轻链（LC3）- Ⅱ的表达;实时逆转录聚合酶链反应 （real-time RT-PCR）检测mTOR、Beclin-1 和LC3 的mRNA 表达;抓力测定实验评价各时间点大鼠前肢 拉力情况;穿梭箱实验测试动物的学习功能。结果 与Sham 组比较,SAH 组海马区mTOR、Beclin-1 和 LC3 mRNA 表达增加,存活神经元细胞数量减少,大鼠的学习功能和拉力值下降,差异有统计学意义（P < 0.05）;与SAH 组比较,雷帕霉素组海马区mTOR mRNA 表达降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细 胞数量增多,大鼠的学习功能和拉力值改善,差异有统计学意义（P <0.05）;与SAH 组比较,BQ-123 组海马区 mTOR mRNA 降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细胞数量增多,动物学习功能指标和拉力值 改善,差异有统计学意义（P <0.05）,且上述变化在高剂量BQ-123 更为明显。结论 BQ-123 可改善SAH 大鼠 神经功能缺陷,抑制mTOR 激活,从而提高海马区神经细胞自噬程度。     

红景天苷对97H细胞自噬的影响

目的：探讨红景天苷对人高转移性肝癌细胞株97H自噬的影响。方法：97H细胞经红景天苷处理后,采用透射电镜、MDC染色和吖啶橙AO染色观察自噬现象;采用qRT-PCR方法检测自噬相关基因的mRNA水平;用Western blot方法检测自噬相关蛋白的表达。结果：红景天苷可诱导97H细胞发生自噬,且上调Beclin-1基因mRNA水平,下调p62基因mRNA水平（P<0.05）,上调Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达,下调p62蛋白的表达（P<0.05）。结论：红景天苷可以诱导97H细胞的自噬作用。     

TNF-琢对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞自噬和增殖的影响及作用机制研究

目的观察TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）自噬和增殖的影响,并进一步通过抑制NF-资B通路来探讨这一影响的作用机制。方法以RASF细胞株MH7A为研究对象,在一阶段实验中,根据5ng/mlTNF-琢处理的时间点不同,将细胞分为6组,即0、3、6、12、24及48h组。在二阶段实验中,将细胞分为4组,即Bay组：细胞用5滋g/mlBay11-7082处理;TNF-α组：细胞用5ng/mlTNF-琢刺激;Bay+TNF-琢组：细胞用5滋g/mlBay11-7082预处理2h,再用5ng/mlTNF-琢刺激;正常对照（Ctrl）组：细胞不作处理。MTT法检测细胞相对活性;共聚焦显微镜下采用GFP-LC3来示踪自噬形成;Westernblot法检测细胞内P-p65、自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-I（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及唯Bcl-2同源-3域蛋白-1（Beclin-1）蛋白表达水平;Realtime-PCR法检测细胞内Beclin-1mRNA表达水平;细胞免疫荧光法检测P-p65在细胞中表达及定位。结果与0h组相比,12、24、48h组细胞相对活性均明显升高（均P＜0.05）。GFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染细胞后,与0h组相比,TNF-琢刺激滑膜细胞后自噬小体形成明显增多,其中24h组最为明显。与0h组相比,3、6、12h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,6、12、24、48h组Beclin-1蛋白表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与0h组相比,6、12、24、48h组Beclin-1mRNA表达水平均明显升高（均P＜0.05）。与TNF-α组相比,Bay+TNF-琢组细胞内P-p65蛋白表达及入核明显减少。与Ctrl组比较,Bay组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降,与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-琢组细胞相对活性明显降低（P＜0.05）。与TNF-琢组相比,Bay+TNF-琢组细胞自噬小体明显减少。与Ctrl组比较,Bay组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）;与TNF-α组比较,Bay+TNF-琢组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降（均P＜0.05）。与Ctrl组比较,Bay组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）;与TNF-琢组比较,Bay+TNF-α组Beclin-1mRNA表达水平明显下降（P＜0.05）。结论TNF-α能诱导RASF自噬和增殖活性,而NF-资B通路则能上调TNF-α刺激下的细胞自噬和增殖活性。     

增强自噬水平对脑缺血预处理神经保护机制的影响

目的 探讨自噬参与脑缺血预处理神经保护机制的影响。 方法 使用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型。100只成年SD大鼠随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组（B组）,缺血预处理组（C组）,缺血再灌注+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)组（D组）,缺血预处理+3-MA组（E组）。D、E组大鼠侧脑室注射3-MA（7.5 μg）,其余3组大鼠注射相同体积的生理盐水。观察各组脑梗死体积、神经功能缺损评分、自噬系统表达水平及神经元凋亡情况。 结果 A组脑梗死体积和神经功能障碍评分均为0;C组脑梗死体积和神经功能障碍评分小于B组;D组脑梗死体积和神经功能障碍评分大于B组,小于C组;E组脑梗死体积和神经功能障碍评分大于C组,小于D组,差异有统计学意义（P＞0.05）。光学显微镜下观察神经元：A组数量多,形态完整;其余4组数量少,形态破坏,细胞核破裂、固缩,其中最为严重的是B组和C组,D组和E组神经元数量较B组和C组增多,细胞水肿及细胞核损伤减轻。A组Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色阳性细胞表达少见;4组Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色阳性细胞表达多。C组Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数大于B组,TUNEL染色阳性细胞数小于B组;D组Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数及TUNEL染色阳性细胞数小于B组和C组,TUNEL染色阳性细胞数大于B组和C组;E组Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞数小于C组,TUNEL染色阳性细胞数小于D组,差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 缺血预处理后细胞自噬能力加强,抑制神经元凋亡,使缺血再灌注后的颅内神经元受到保护。     

天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管内皮细胞 自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/mTOR 的影响

目的 探讨天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠（SHR）血管内皮细胞自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/ mTOR 的影响。方法 将30 只雄性SHR 大鼠随机分为SHR 组、尼莫地平组（5.4 mg/kg）及天麻钩藤饮组 （10.26 g/kg）,另设京都种大鼠（WKY）作为对照组,灌胃体积为10 ml/kg,连续给药6 周。采用无创血压仪 分别检测各组给药前、给药2 周后、给药4 周后及给药6 周后的大鼠尾动脉收缩压;采用酶联免疫吸附法 （ELISA）检测给药6 周后各组大鼠血浆血管紧张素Ⅱ（ANG Ⅱ）、白细胞介素1（IL-1）及钙调素（CaM） 水平;采用Western blot 检测给药6 周后各组大鼠血管内皮细胞中自噬标志物（Beclin-1）、微管相关蛋白 轻链（LC3- Ⅱ）及自噬通路相关腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）,以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR） 的表达情况;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测给药6 周后各组大鼠血管内皮细胞中自噬通路相 关AMPK、mTOR 基因的表达情况。结果 与WKY 组比较,SHR 组大鼠尾动脉收缩压增高,血浆ANG Ⅱ、 IL-1 及CaM 含量增加,血管内皮细胞中自噬标志物Beclin-1、LC3- Ⅱ和自噬通路相关AMPK、mTOR 蛋白 及mRNA 表达水平均上调（P <0.05）;与SHR 组比较,尼莫地平组和天麻钩藤饮组大鼠血压均降低（P <0.05）, 血浆ANG Ⅱ、IL-1 及CaM 含量下降,且两者血管内皮细胞中自噬标志物Beclin-1、LC3- Ⅱ和自噬通路相 关AMPK、mTOR 蛋白及mRNA 表达水平均降低（P <0.05）。结论 天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管内 皮细胞自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/mTOR 具有明显的调控作用,可能是其降压的重要机制之一。     

不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖的影响

目的探讨不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法使用0（对照）、10、25、50滋g/L的雷帕霉素（RAPA）预处理人胶质瘤细胞（U87细胞）0.5h;再加入200滋mol/L替莫唑胺作用24h,收集U87细胞。采用流式细胞术检测自噬标志物微管相关轻链蛋白3（LC3）-Ⅱ表达量,RT-PCR法检测自噬相关基因Beclin-1mRNA相对表达量,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果对照组、10滋g/L组、25滋g/L组和50滋g/L组U87细胞LC3-Ⅱ表达量、Beclin-1mRNA相对表达量及细胞增殖抑制率比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;经两两比较发现,随着RAPA浓度的增加,LC3-Ⅱ表达量及Beclin-1mRNA相对表达量均逐渐升高（均P＜0.05）,而细胞增殖抑制率先下降后逐步升高（均P＜0.05）。结论不同水平自噬对替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞增殖产生不同的影响,随着自噬水平的提高,替莫唑胺对神经胶质瘤细胞的增殖抑制率先下降后逐渐升高。     

芦荟大黄素对阿尔茨海默病大鼠PI3K/AKT/mTOR通路介导自噬的影响

目的 研究芦荟大黄素对阿尔茨海默病（Alzheimers disease,AD）大鼠的神经保护作用以及可能的调控机制。方法 选择健康雄性SD大鼠30只,采用随机分组的方式将大鼠分为空白组、模型组和芦荟大黄素组,每组10只。采用腹腔注射D-半乳糖和双侧颅内海马注射Aβ25-35的方式联合进行AD大鼠模型的复制。芦荟大黄素组大鼠按10 mL/kg给予芦荟大黄素混悬液,空白组和模型组给予等容积纯水,共28 d。Morris水迷宫试验检测大鼠学习记忆能力,苏木精-伊红染色观察海马CA1区神经细胞损伤情况,Western blot法和qRT-PCR法分别检测大鼠海马磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin,mTOR）通路蛋白、自噬相关蛋白及其mRNA的表达水平。结果 AD大鼠学习记忆能力明显下降（P＜0.05）,海马CA1区神经细胞出现明显损伤,而芦荟大黄素可显著改善 AD大鼠学习记忆能力（P＜0.05）,减轻海马CA1区神经细胞损伤;AD大鼠海马p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、P62蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）,Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,而芦荟大黄素可以显著减少AD大鼠海马p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、P62的蛋白表达水平（P＜0.05）,显著增加Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平（P＜0.05）;AD大鼠海马PI3K、AKT、mTOR、P62 mRNA表达水平显著增加（P＜0.05）,Beclin-1和LC3 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）,而芦荟大黄素可以显著减少大鼠海马PI3K、AKT、mTOR、P62 mRNA表达水平（P＜0.05）,显著增加Beclin-1和LC3 mRNA表达水平（P＜0.05）。结论 芦荟大黄素能够显著改善AD大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导的自噬来实现的。     

姜黄素保护帕金森病多巴胺能神经元的机制研究

目的: 观察姜黄素对帕金森病细胞模型中多巴胺能神经元的保护作用并探讨其作用机制。方法: 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞采用1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（MPTP）处理建立帕金森病细胞模型,进一步设立姜黄素干预、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预以及姜黄素和3-MA同时干预组。各组细胞在药物处理48 h后分别进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色观察多巴胺能神经元存活数;蛋白质印迹法检测α-突触核蛋白（α-Syn）、转录因子EB（TFEB）、自噬相关蛋白多克隆抗溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的蛋白表达;RT-PCR检测α-Syn的mRNA表达。结果: 与模型对照组比较,姜黄素组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.01）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（均P < 0.01）,TFEB以及自噬蛋白LAMP2A和LC3-Ⅱ表达上调（均P < 0.01）;3-MA和姜黄素同时干预组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.05）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（P < 0.05或P < 0.01）,TFEB、LAMP2A和LC3-Ⅱ蛋白表达上调（均P < 0.01）。与姜黄素组比较,姜黄素和3-MA同时干预组多巴胺能神经元存活数减少,LC3-Ⅱ和LAMP2A蛋白表达减少（均P < 0.05）。结论: 姜黄素可激活细胞自噬功能促进α-Syn自噬性清除,从而减轻MPTP所致的多巴胺能神经元损伤。     

Homer 1b/c通过内质网功能调节由谷氨酸诱发的HT22细胞自噬

目的　研究Homer1b/c蛋白在谷氨酸诱发的细胞自噬中的作用及机制。方法　选用小鼠海马细胞系HT22细胞,通过500 ?mol/L谷氨酸处理建立细胞损伤模型。用siRNA慢病毒转染方式下调Homer1b/c表达和10 ?mol/LBAPTA-AM（1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N`,N`-四乙酸四乙酸甲酯,钙离子螯合剂）、10 mmol/L4-PBA（4-苯基丁酸,内质网应激抑制剂）分别抑制细胞内钙离子释放和内质网应激后,使用蛋白质印迹法检测Homer1b/c,自噬蛋白Beclin-1、微管相关蛋白轻链3（LC3）,以及内质网应激标志蛋白CHOP（人内质网应激相关蛋白）、GRP-78(葡萄糖调节蛋白78)的表达水平。每组实验均进行3次,采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学分析。结果　谷氨酸处理HT22细胞12 h后,Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高（P<0.05）,下调Homer1b/c表达可降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。抑制细胞内钙离子释放和抑制内质网应激均能降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。然而在下调Homer1b/c表达后,抑制细胞内钙离子释放和抑制内质网应激未能进一步降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。结论　Homer1b/c能够调节谷氨酸诱导的自噬,其调节作用可能与内质网功能有关。     

Homer 1b/c通过内质网功能调节由谷氨酸诱发的HT22细胞自噬

目的　研究Homer1b/c蛋白在谷氨酸诱发的细胞自噬中的作用及机制。方法　选用小鼠海马细胞系HT22细胞,通过500 ?mol/L谷氨酸处理建立细胞损伤模型。用siRNA慢病毒转染方式下调Homer1b/c表达和10 ?mol/LBAPTA-AM（1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N`,N`-四乙酸四乙酸甲酯,钙离子螯合剂）、10 mmol/L4-PBA（4-苯基丁酸,内质网应激抑制剂）分别抑制细胞内钙离子释放和内质网应激后,使用蛋白质印迹法检测Homer1b/c,自噬蛋白Beclin-1、微管相关蛋白轻链3（LC3）,以及内质网应激标志蛋白CHOP（人内质网应激相关蛋白）、GRP-78(葡萄糖调节蛋白78)的表达水平。每组实验均进行3次,采用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学分析。结果　谷氨酸处理HT22细胞12 h后,Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高（P<0.05）,下调Homer1b/c表达可降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。抑制细胞内钙离子释放和抑制内质网应激均能降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。然而在下调Homer1b/c表达后,抑制细胞内钙离子释放和抑制内质网应激未能进一步降低Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高程度（P<0.05）。结论　Homer1b/c能够调节谷氨酸诱导的自噬,其调节作用可能与内质网功能有关。     

自噬在早期糖尿病大鼠视网膜神经病变中的作用

目的 探索自噬在糖尿病大鼠视网膜损伤中的表达变化及其与视网膜神经节细胞(RGC)损伤的相关性.方法 共有60只Wistar大鼠经链脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病大鼠模型.造模成功后,分别在糖尿病0、4、12周检测RGC数量、视网膜电图(ERG)、视网膜血管形态学变化,Western blot法检测自噬标记物LC3b-Ⅱ与Beclin-1的蛋白表达,免疫组化法检测LC3b-Ⅱ在视网膜上的表达部位.结果 糖尿病造模成功后,视网膜RGC数在第12周时减少至0周时的(88.6±2.2)%,差异有统计学意义(P<0.05).并且ERG的b波以及总振幅在第4周时就出现降低,差异有统计学意义(P<0.01).Western blot检测显示,糖尿病4周和12周大鼠视网膜中的LC3b-Ⅱ和Beclin-1表达均逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05).免疫组化方法显示LC3b-Ⅱ在各时期糖尿病大鼠视网膜中的视网膜神经节细胞层表达阳性.结论 糖尿病视网膜病变中自噬参与了RGC的损伤.     

柴胡疏肝散对抑郁症大鼠行为学和海马神经元凋亡及自噬的影响

目的：观察柴胡疏肝散对抑郁症模型大鼠海马神经元凋亡和自噬的拮抗作用,探讨柴胡疏肝散抗抑郁症的作用机制。方法：60只雄性成年SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和给药组。通过给予慢性不可预见温和应激建立抑郁症模型;对照组和模型组给予同体积生理盐水,给药组在模型基础上给予柴胡疏肝散饮片溶液。采用糖水偏好实验、悬尾实验和Morris水迷宫实验进行行为学检测,流式细胞术检测大鼠海马神经元凋亡,Western blotting法检测自噬微管相关蛋白轻链3(LC-3)和自噬基因Beclin-1蛋白的表达。结果：与对照组比较,模型组和给药组大鼠糖水偏好百分比降低（P<0.05）,悬尾不动时间和逃避潜伏期延长（P<0.05）,细胞凋亡率、LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平升高（P<0.05）;与模型组比较,给药组大鼠糖水偏好百分比升高（P<0.05）,悬尾不动时间和逃避潜伏期缩短（P<0.05）,细胞凋亡率、LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论：柴胡疏肝散具有显著的抗抑郁作用,可能与拮抗大鼠海马神经元凋亡和降低自噬有关。     

二甲双胍促进AMPK、TFEB表达改善自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究二甲双胍(Met)对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:建立大鼠脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组、缺血再灌注组、Met预处理组[造模前3周腹腔注射Met 100 mg/(kg·d)],TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积改变，HE染色观察脑组织病理变化；蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62等自噬相关蛋白以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK(Thr172)、转录因子EB(TFEB)相关通路蛋白含量。结果:与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织病理损伤严重，脑梗死体积增高(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠脑梗死体积减少(P<0.01),脑组织病理损伤减轻。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平表达减少(P<0.05),p62蛋白表达增多(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达均增多(P<0.05),p62蛋白表达减少(P<0.01);与假手术组相比，缺血再...     

rhG-CSF对大鼠缺血缺氧神经元巨自噬水平的影响

目的:探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对缺血缺氧神经元巨自噬水平的影响及意义。方法:采取氧糖剥夺法制作细胞缺氧模型,Western blot法检测0、100、200μg/L rhG-CSF干预下细胞巨自噬标志微管相关蛋白轻链3膜型和胞质型比值(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)的变化,单丹磺酰戊二胺(MDC)法荧光观察巨自噬空泡变化,MTT法检测细胞活力。应用改良线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型,rhG-CSF干预前及干预7 d后进行改良的神经功能缺损评分评定,Western blot法检测干预7 d后大鼠皮层神经元LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,免疫组化法检测LC3蛋白的表达。结果:随着rhG-CSF给药剂量的增加,细胞缺氧模型LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和巨自噬空泡数量逐渐增加(F=288.686,154.698,P<0.001),细胞活力也相应增强(F=74.456 P<0.001)。动物实验中,干预7 d后,rhG-CSF组大鼠缺血神经元LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(F=573.085,P<0.001)及LC3阳性细胞数(F=88.945,P<0.001)分别较假手术组及模型组上调,大鼠的神经功能缺损评分较干预前明显降低(F组间=20.403,F时间=19.193,F交互=33.415,P<0.001)。结论:局灶性脑缺血后rhG-CSF可能通过上调巨自噬水平参与神经元的保护。     

鞘内注射吗啡诱导脊髓背角自噬状态的改变

目的研究鞘内注射吗啡诱导吗啡耐受过程中大鼠脊髓背角自噬状态的变化。方法选择鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠48只,随机分为M组和C组,每组24只。M组2次/d,连续7 d鞘内注射吗啡20μg;C组2次/d,连续7 d鞘内注射生理盐水。于鞘内注射前及第1、3、5、7天第2次鞘内注药后30 min采用电子VonFrey测痛仪测定机械缩足反射阈值,然后随机取6只大鼠L4～6脊髓背角采用Western blot测定自噬标记蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节信号相关蛋白Beclin-1的表达。结果鞘内注射吗啡7 d后,吗啡镇痛作用较第1天下降60.2%,提示出现吗啡耐受形成。C组各时点LC3Ⅱ及Beclin-1均有少量表达,各时点比较差异无统计学意义;与C组比较,M组各时间点脊髓背角Beclin-1、LC3Ⅱ表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著上调(P<0.05);M组内不同时点比较,第1天LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值最高(P<0.05),随后逐渐下降;第1天Beclin-1表达最高(P<0.05),随后下降,在第5天后表达量趋于稳定。结论鞘内注射吗啡可诱导脊髓背角自噬增加,Beclin-1可能参与鞘内注射吗啡诱导所致的自噬状态改变。     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素（APG）对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性（P<0.05）;20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系（P<0.05）。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加（P<0.05）,芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值（P<0.05）,下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值（P<0.05）。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高（P<0.05）。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关     

异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响

目的：探讨吸入麻醉药异氟醚对β淀粉样蛋白（Aβ）25-35诱导的大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将PC12细胞随机分为正常对照组（C组）、10   μmol•L-1Aβ25-35 处理组（Aβ组）、2%异氟醚处理组（Iso组）和2%异氟醚与10   μmol•L-1Aβ25-35联合处理组（Iso+Aβ组）。各组PC12细胞药物处理6 h后应用透射电镜观察自噬体,Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62和自噬信号调控基因p-mTOR、Beclin-1表达;药物处理24 h后应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞存活率,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达。结果：与C组比较,Aβ组PC12细胞中可见大量的自噬体,LC3-Ⅱ、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,p62、p-mTOR和Bcl-2表达量降低（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;Iso组PCI2细胞未见自噬体,LC3-Ⅱ
表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）;与Aβ组比较,Iso+Aβ组PC12细胞仅见少量自噬体,LC3-Ⅱ表达量降低（P<0.05）,p62、p-mTOR、Beclin-1和caspase-3表达量升高（P<0.05）,细胞存活率降低（P<0.05）,Bcl-2表达无明显变化（P>0.05）。结论：异氟醚能够抑制Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬的活化,促进凋亡蛋白的表达,其作用机制与激活自噬信号调控基因mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。     

七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤肺组织细胞自噬水平的影响

目的 探讨七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)肺组织中细胞自噬的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠75只,采用开胸夹闭左肺门建立IRI模型,将75只大鼠编号后按随机数字表法分为5组:假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),七氟烷预处理组(SEVO),LY294002组(LY)及七氟烷预处理+LY294002组(PI3K抑制剂)(SEVO+LY),各15只.缺血1h,再灌注120 min后处死各组大鼠,取出肺组织,检测大鼠肺组织湿/干重比(W/D),Western blot法测定肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及p-PI3K表达.结果 与Sham组比较,I/R组肺组织发生严重水肿(P＜0.05),且肺组织细胞自噬水平增加,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调(P＜0.05);与I/R组比较,SEVO组肺水肿明显减轻(P＜0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达下调,而p-PI3K表达增加(P＜0.05),LY组与I/R组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);与SEVO组比较,SEVO+ LY组中肺水肿明显加重,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调而p-PI3K表达下调(P＜0.05).结论 七氟烷预处理通过激活PI3K信号转导通路,恢复LIRI期间细胞自噬流,减少自噬性细胞死亡从而对肺缺血再灌注损伤起保护作用.