视黄酸核受体γ重组腺病毒构建及其鉴定

目的 构建携带大鼠视黄酸核受体γ(retinoic acid receptor γ,RARγ)的重组腺病毒,为研究RARγ在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化中的作用奠定基础.方法 体外扩增大鼠RARγ基因,将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TOX构建重组质...     

P27特异性siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的 构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性p27基因表达的影响.方法 合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用Not Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle-H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd-P27-siRNA和pAd-NC重组腺病毒.用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平.结果 重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达.结论 成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础.     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响.方法 设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QBI293A细胞中包装,获得RAGE-siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE-siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达.结果 成功制备RAGE-siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE-siRNA感染效率达到90 %以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达.结论 成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达.     

表达miR-10α的重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达miR．10a的重组腺病毒（adenovirus,Ad）载体。方法用红色荧光蛋白mCherry基因替换穿梭质粒pDC316-EGFP—U6的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因。利用表达siRNA的策略,合成编码miR-10a的长链DNA序列,双链退火后克隆至pDC316,mCherry—U6获得pDC316-mCherry—U6-miR-10α。pDC316-mCherry-U6-miR-10α与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒Ad-miR-10α空斑形成实验纯化、扩增、滴定重组腺病毒。Ad-miR-10α感染HeLa细胞后在荧光显微镜下观察mCherry表达,用RT—qPCR检测miR-10α表达。结果构建的pDC316-mCherry—U6-miR-10α序列正确,荧光显微镜下可见mCherry的表达,重组腺病毒Ad—miR-10α滴度为1．8×10^7pfu／mL,感染HeLa细胞后miR-10α表达较mock高40倍。结论成功构建了表达miR-10α的首组腺病毒．siRNA表达策略可用于miRNA的人工表达。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的 构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具.方法 人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western 印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化.结果 成功构建了MKRN1的siRNA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性.结论 构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具.     

表达miR-10a的重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达miR-10a的重组腺病毒(adenovirus,Ad)载体.方法 用红色荧光蛋白mCherry基因替换穿梭质粒pDC316-EGFP-U6的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因.利用表达siRNA的策略,合成编码miR-10a的长链DNA序列,双链退火后克隆至pDC316-mCherry-U6获得pDC316-mCherry-U6-miR-10a.pDC316-mCherry-U6-miR-10a与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒Ad-miR-10a,空斑形成实验纯化、扩增、滴定重组腺病毒.Ad-miR-10a感染HeLa细胞后在荧光显微镜下观察mCherry表达,用RT-qPCR检测miR-10a表达.结果 构建的pDC316-mCherry-U6-miR-10a序列正确,荧光显微镜下可见mCherry的表达,重组腺病毒Ad-miR-10a滴度为1.8 × 107pfu/mL,感染HeLa细胞后miR-10a表达较mock高40倍.结论 成功构建了表达miR-10a的重组腺病毒,siRNA表达策略可用于miRNA的人工表达.

Abstract：

Objective To develop a miR-10a-expressing recombinant adenoviral vector. Methods The EGFP gene in shuttle plasmid pDC316-EGFP-U6 was replaced by red fluorescent protein mCherry gene. Long DNA sequence coding miR-l0a was synthesized. After annealing, the double-stranded miR-10a-coding sequence was inserted into pDC316-mCherry-U6. The resultant pDC316-mCherryU6-miR-10a was co-transfected with adenoviral skeleton plasmid pBHGlox△E1, 3Cre into HEK293 cells. The replication-defective adenovirus Ad-miR-10a was purified, amplified, and tittered by plaque assay. The mCherry expression was detected by fluorescence microscope. The expression of miR-10a by Ad- miR- 10 a in HeLa cells was determined by RT-qPCR. Results The sequence of pDC316-mCherryU6-miR-10 a was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. mCherry expression could be detected under fluorescence microscope. The titers of Ad-miR-10a was 1.8 × 107 pfu/mL, and the level of miR-10a expression in HeLa cells infected with Ad-miR-10a was 40 times higher than that with Admock. Conclusion A miR-10a-expressing recombinant adenovirs Ad-miR-10a has been successfully constructed. The strategy for artificial expression of siRNA is applicable for expression of miRNA.     

大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。     

表达miR-10a的重组腺病毒的构建与鉴定

Objective To develop a miR-10a-expressing recombinant adenoviral vector. Methods The EGFP gene in shuttle plasmid pDC316-EGFP-U6 was replaced by red fluorescent protein mCherry gene. Long DNA sequence coding miR-l0a was synthesized. After annealing, the double-stranded miR-10a-coding sequence was inserted into pDC316-mCherry-U6. The resultant pDC316-mCherryU6-miR-10a was co-transfected with adenoviral skeleton plasmid pBHGlox△E1, 3Cre into HEK293 cells. The replication-defective adenovirus Ad-miR-10a was purified, amplified, and tittered by plaque assay. The mCherry expression was detected by fluorescence microscope. The expression of miR-10a by Ad- miR- 10 a in HeLa cells was determined by RT-qPCR. Results The sequence of pDC316-mCherryU6-miR-10 a was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. mCherry expression could be detected under fluorescence microscope. The titers of Ad-miR-10a was 1.8 × 107 pfu/mL, and the level of miR-10a expression in HeLa cells infected with Ad-miR-10a was 40 times higher than that with Admock. Conclusion A miR-10a-expressing recombinant adenovirs Ad-miR-10a has been successfully constructed. The strategy for artificial expression of siRNA is applicable for expression of miRNA.     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。 目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。 方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1 080 bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。 结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

GAP- 43干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建GAP-43小干扰RNA（SiRNA）的表达载体并在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12中验证其抑制效果。方法：利用设计软件根据GAP-43 mRNA序列没计特异性SiRNA插入序列，体外合成该序列后将其定向克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo。以Lipofectamine^TM2000试剂转染GAP-43-SiRNA表达载体至PC12细胞中，以NGF诱导PCI2细胞GAP-43的表达，以免疫组化方法鉴定GAP-43-SiRNA对GAP．43表达的抑制效果。结果：DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT HL1／Neo的SiRNA插入序列完全正确，GAP-43-SiRNA表达载体转染PC12细胞后可特异性抑制NGF诱导的PC12细胞的GAP-43的表达。结论：GAP-43-SiRNA表达载体构建成功，为后期研究GAP-43在少突胶质细胞前体上表达的意义奠定了基础。     

转录因子Twist的siRNA筛选、腺病毒构建及功能检测

目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组(P<0.05).结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具.     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的探讨构建雌激素受体α（ERα）亚基基因小干扰RNA（siRNA）表达载体的方法，为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据。方法利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA，体外合成siRNA基因，并将其定向克隆入pSilencer4．1-CMV质粒中，构建真核表达载体。采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果双酶切法鉴定重组质粒后，RT-PCR法鉴定ERasiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达。结论ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建，为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据。     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的 探讨构建雌激素受体α(ERα)亚基基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的方法,为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据.方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA,体外合成siRNA基因,并将其定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建真核表达载体.采用PCR扩增、酶切分析鉴定.结果 双酶切法鉴定重组质粒后,RT-PCR法鉴定ERαsiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达.结论 ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建,为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据.     

Pokemon基因siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定

目的针对Pokemon基因对于许多肿瘤抑制基因和原癌基因上游的作用,将其作为RNAi的靶基因,构建表达这些siRNA的重组逆转录病毒表达质粒。方法利用Ambion公司的网上设计工具设计针对Pokemon肿瘤基因的4条siRNA序列,并化学合成4对互补的siRNA的DNA片段。将此双链DNA片段克隆到pSilencer 5．1-H1 Retro vector的Bam HⅠ和HindⅢ位点,构建其逆转录病毒重组表达质粒。结果表达人类Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒构建成功。结论我们成功构建了人类Pokemon基因的重组逆转录病毒重组表达质粒,为下一步Pokemon基因的RNA干扰提供了实验依据,并且开辟了肿瘤基因治疗的新思路。     

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。     

IκBαM重组腺病毒的构建

为从分子水平研究NF κB/IκBα系统复杂的生物学功能特别是在肿瘤抗凋亡机制中的作用、进而应用其进行肿瘤及其它多种疾病的基因治疗研究 ,我们在成功克隆IκBα基因基础上 ,构建了NF κB超抑制物IκBαM。在此基础上应用新型腺病毒载体构建系统AdEasysys tem构建重组腺病毒AdIκBαM。首先将目的基因IκBαM克隆至穿梭质粒Track CMV质粒 ,提取重组Track IκBαM质粒 ,行单酶切及双酶切鉴定 ,表明重组穿梭质粒Track IκBαM构建成功。以碱法提取重组穿梭质粒Track IκBαM基金项目 :国家 863计划资助项目( 2 0 0 1AA2 1712…     

MEKK3基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞MEKK3的表达抑制

目的 构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体表达载体,观察其在胃腺癌AGS细胞中对MEKK3的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEKK3基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,得到的质粒用PmeⅠ线性化后在大肠埃项菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.卡那霉素筛选后,用PacⅠ酶切鉴定.鉴定正确的质粒经PacⅠ酶切、乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK3-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western印迹法检测其对MEKK3蛋白表达的抑制.结果酶切和测序鉴定表明3个MEKK3 siRNA重组腺病毒表达载体正确无误.Western印迹检测结果显示3个pAd-MEKK3-siRNA重组腺病毒表达载体中有两个可有效地抑制胃腺癌AGS细胞中MEKK3基因的表达,其中以pAd-MEKK3-siRNA3的抑制作用最显著,有效率达89 %.结论 成功构建了针对MEKK3基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究MEKK3基因在人胃腺癌AGS细胞中的作用和功能奠定了基础.     

重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响

目的构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响。方法设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ。腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态。结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致。腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%。其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P0.05)。ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P0.05)。结论成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化。     

PNPLA3基因表达以及干扰腺病毒的构建及鉴定

目的 构建糖脂代谢和脂肪肝相关基因PNPLA3过表达以及干扰腺病毒载体并加以鉴定.方法 根据PNPLA3基因序列设计过表达以及干扰序列引物,定向克隆人穿梭载体pAdTraek-CMV的Bgl Ⅱ和Xho I位点,干扰序列克隆人pAdTrack-U6穿梭载体,Pme I酶切线性化穿梭质粒与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共转化E.coli BJ5183感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I酶切线性化的回收质粒转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293A细胞绿色荧光蛋白的表达,并初步观察其感染小鼠原代细胞的效率.结果 测序、酶切鉴定证实,构建出了PNPL43基因过表达及干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.5×10<'11>VP/mL.以120感染复数感染小鼠肝脏原代细胞,感染效率可达到90%以上,干扰效率超过80%以上.结论 成功构建了PNPLA3基因的过表达以及干扰腺病毒载体.     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建细胞周期蛋白E(Cyclin E)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Cyclin E表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGENESIL/Cyclin E-1和pGENESIL/Cyclin E-2)进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果Cyclin E siRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。