EphA5介导胚胎中脑神经上皮干细胞向纹状体投射的实验研究

目的探讨轴突导向分子EphA5在胚胎中脑神经上皮干细胞向靶组织纹状体特异性投射中的作用。方法自孕11d大鼠取材胚胎中脑神经上皮干细胞并进行体外培养,应用免疫细胞化学的方法检测EphA5在神经上皮干细胞中的表达情况;取材鼠脑纹状体组织,应用冰冻切片、RT-PCR及Western-blot等方法检测EphA5的配体Ephrin-A5的特异表达情况;将胚胎中脑神经上皮干细胞与新生鼠纹状体组织块联合培养,观察细胞的靶向生长情况。结果体外培养的胚胎中脑神经上皮干细胞可明显向纹状体生长并呈EphA5阳性,靶区纹状体组织中可检测到其配体Ephrin-A5高表达。结论轴突导向分子EphA5受体及其配体Ephrin-A5可介导胚胎中脑神经上皮干细胞向纹状体组织的靶向生长。     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

慢病毒介导的GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的:研究GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响,同时探讨可能的作用机制。方法:构建靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体,用流式细胞术确定转染效率,用RT-PCR和Western blotting法检测其对人类肝细胞癌细胞株Huh-7的干扰效果,流式细胞术检测细胞凋亡比例,Western blotting法检测各转染组Huh-7细胞NF-κB及Bcl-2蛋白表达。结果:靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体感染肝癌Huh-7细胞后,转染效率为57.4%。GATA6在mRNA和蛋白水平的表达明显下降。GATA6沉默的肝癌Huh-7细胞凋亡比例增加(P0.05),NF-κB和Bcl-2蛋白水平表达降低。结论:利用慢病毒载体干扰技术沉默GATA6基因的表达可以明显促进Huh-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节凋亡相关蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡。靶向GATA6的RNA干扰技术在肝癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化；Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著高于对照组（P<0.05）；DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示，用10 mg/L CDDP处理36 h后，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组（P<0.05），形成DNA条带；Western blotting显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论：下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长，增加细胞对化疗药物的敏感性，提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。     

转铁蛋白受体1对小鼠海马神经元生长与分化的影响

目的探讨转铁蛋白受体1(TfR1)对小鼠海马神经元生长与分化的影响。方法取胚胎18.5 d小鼠原代海马神经元培养,培养7 d后使用TfR1 shRNA p GFP-V-RS干扰质粒转染小鼠海马原代神经元使TfR1基因沉默,采用绿色荧光蛋白(GFP)分析及Western blotting技术检测TfR1 shRNA的转染效率;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及TUNEL法检测干扰后海马神经细胞凋亡情况,免疫荧光技术检测凋亡后神经细胞骨架的变化及神经元突起生长的形态特征。结果 TfR1 shRNA质粒能有效使神经细胞内TfR1基因沉默;TfR1基因沉默后,原代海马神经细胞凋亡率增加,细胞骨架部分崩解,且神经元树突突起长度明显增长(P0.05)。结论转铁蛋白受体1可通过调控小鼠海马神经元树突的生长来影响海马神经元的分化。     

RUNX3小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨RUNX3基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建RUNX3基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotitng进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素敏感性的变化；Western blotting检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6、p21、 p27和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了RUNX3的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的RUNX3低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞的生长速度显著快于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著低于对照组（P<0.05）；MTT法和流式细胞仪结果显示, 转染RUNX3小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；Western blotting显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞中Bcl-2、P-gp和cyclin D1的表达明显增高，p21的表达明显降低。结论:下调RUNX3基因能促进神经母细胞瘤细胞生长，降低细胞对化疗药物的敏感性，提示RUNX3在神经母细胞瘤的发生和发展中可能扮演重要角色。     

携带靶向干扰小鼠早期生长反应基因1短发夹RNA的慢病毒载体转染小鼠视网膜的干扰效率研究

目的 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)和靶向干扰早期生长反应基因1(Egr-1)短发夹RNA(shRNA)共表达的慢病毒载体,转染小鼠视网膜组织,观察其对Egr-1基因的干扰效率.方法 针对已经筛选确定的Egr-1基因shRNA有效靶序列,构建携带GFP和靶向干扰Egr-1 shRNA的慢病毒载体LV-shRNA(Egr...     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

RNA干扰抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达,以期为肿瘤的基因治疗提供新的思路和手段。方法构建逆转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌细胞HCT-8中的表达,同时利用Western免疫印迹和免疫组织化学SP法分别检测转染后HCT-8细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果从EphA2 mRNA序列中筛选出有效的siRNA序列,并设计了互补双链寡核苷酸发夹结构,成功构建了EphA2 siRNA的逆转录病毒表达载体,重组逆转录病毒载体pSIREN-EphA2经酶切鉴定结果正确;测序分析证实插入的EphA2 siRNA的方向及序列正确。Western免疫印迹和免疫组织化学方法分析,与对照空载体及未转染细胞相比,重组pSIREN-EphA2转染的HCT-8细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．001）。结论通过逆转录病毒载体介导的RNAi能够抑制HCT-8细胞中EphA2的蛋白表达,为以EphA2为靶向的结直肠癌的基因治疗提供了新的思路和手段。     

CDK1靶向shRNA质粒载体的构建及鉴定

目的:设计并构建CDKI -shRNA质粒表达载体,转染肝癌HepG2细胞,验证shRNA对肝癌HepG2细胞CDK1基因的沉默效应,便于进一步研究CDK1的功能.方法:设计针对CDK1 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体片段进行连接、转化.经测序等方法鉴定重组克隆.将重组载体质粒经脂质体包裹转染肝癌HePG2细胞,realtime PCR及Western blot检测RNA干扰效果.结果:重组克隆经测序证实插入的序列正确,realtime PCR及Western blot检测证实设计的3条RNA干扰序列有效沉默了肝癌HepG2细胞中的内源性CDKI.结论:所制备的CDK1-shRNA在肝癌HepG2细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CDK1为靶向的shRNA能够有效下调CDK1基因的表达,对周期依赖激酶CDK1功能的研究奠定基础.