糖毒性下UCP2介导的胰岛功能紊乱的研究

目的 研究不同浓度高糖对胰岛INS-1细胞解偶联蛋白2(UCP2)基因表达的影响,探讨UCP2基因与高糖刺激下氧化应激和胰岛素分泌之间的关系,进一步了解糖尿病糖毒性的发病机制.方法 将不同浓度的葡萄糖作用于INS-1细胞,镜下观察INS-1细胞的形态改变,应用可见分光光度计测定丙二醛(MDA)含量,运用ELISA方法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS),同时应用RT-PCR方法检测UCP2基因的表达.结果 ①随着糖浓度的增加,INS-1细胞的凋亡增多,MDA含量逐渐增加,GSIS值逐渐下降,不同糖浓度组比较,差异具有显著性意义(P<0.01).②随着葡萄糖浓度增加,INS-1细胞UCP2 mRNA的表达总体逐渐增强.结论 高糖可促进INS-1细胞凋亡,在高糖作用下活性氧物质(ROS)代谢产物MDA增多,通过激活UCP2的途径引起胰岛细胞胰岛素分泌功能受损.这可能也是糖毒性对胰岛β细胞损害的一个重要环节.     

高糖和棕榈酸诱导胰岛INS-1细胞线粒体解偶联改变

目的 通过观察体外高糖和棕榈酸(PA)慢性作用对胰岛INS-1细胞活性氧簇(ROS)水平、解偶联蛋白2(UCP2)mRNA和蛋白表达的影响,初步探讨高糖和PA损害胰岛功能的机制.方法 实验分为正常对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖的BSA)、高糖组(含16.7 mmol/L葡萄糖的BSA)、棕榈酸组(含0.4 mmol/L棕榈酸)、高糖+棕榈酸组(含16.7 mmol/L葡萄糖及0.4 mmol/L棕榈酸).将INS-1细胞分别接种于上述不同浓度的葡萄糖和PA作用48h后,分别分析ROS水平、UCP2mRNA和蛋白表达、基础和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量(GSIS). 结果 与对照组相比,高糖组、棕榈酸组和高糖+棕榈酸组ROS水平明显增加(P均<0.05);高糖+棕榈酸组解偶联蛋白2(UCP2)mRNA和蛋白表达较其余三组明显增加(P均<0.05);并且它明显增加2.8 mmol/L葡萄糖时的基础胰岛素分泌量,减少16.7 mmol/L葡萄糖时的GSIS(P均<0.05). 结论 在胰岛INS-1细胞,高糖和棕榈酸对胰岛功能的损害与线粒体解偶联功能改变有关.高糖和棕榈酸通过诱导ROS产生增多导致UCP2表达与作用增加,增强了线粒体呼吸链与ADP磷酸化解偶联,使线粒体膜电位下降,引起胰岛素分泌减少,损害胰岛功能.     

内毒素脂多糖对胰岛细胞株INS-1细胞活力及胰岛素分泌的影响

目的 观察Toll样受体4(TLR4)在胰岛细胞株(INS-1)中的表达情况,探讨内毒素脂多糖(LPS)对INS-1细胞活力、胰岛素分泌功能以及TLR4表达的影响.方法 采用RT-PCR技术和Western blotting方法检测INS-1细胞和经1 mg/L LPS刺激的INS-1细胞中TLR4 mRNA和蛋白的表达变化;分别用不同质量浓度的LPS (0.01、0.1、1、5、10 mg/L)刺激INS-1细胞,CCK8法检测细胞活力,GSIS法测定胰岛素分泌功能.结果 RT-PCR和Western blotting检测结果显示:LPS刺激使INS-1细胞TLR4mRNA和蛋白的表达显著增加(P＜0.05).当LPS在0.1～ 10 mg/L时,INS-1细胞活力受到抑制,且呈剂量时间依赖性(P＜0.05);1 mg/L LPS刺激可使高糖环境下的INS-1细胞的胰岛素分泌量显著减少(P＜0.05).结论 一定浓度范围内的LPS刺激可抑制INS-1细胞活力,并减少高糖培养条件下细胞胰岛素的分泌量.LPS刺激能上调INS-1细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达.内毒素可能通过直接作用损伤胰岛β细胞.     

Apelin对葡萄糖的毒性作用及对胰岛细胞PDX-1表达的影响

目的 探讨Apelin对葡萄糖毒性作用及对胰岛细胞胰十二指肠同源盒蛋白-1(PDX-1)表达的影响.方法 在不同葡萄糖浓度下(正糖组5.6 mmol/L,高糖组16.7 mmol/L,极高糖组33.3 mmol/L),+/-Apelin-36培养胰岛β细胞株NIT-1细胞3d,然后测定基础和葡萄糖刺激后胰岛细胞胰岛素分泌量,测定细胞内胰岛素含量和PDX-1蛋白及mRNA表达.结果 与正糖组比较,高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素均明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P＜0.05);与未加Apelin组比较,加Apelin高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P＜0.05);6组胰岛细胞的胰岛素水平与PDX-1蛋白表达呈正相关,与PDX-1 mRNA表达无关.结论 Apelin可能通过降低PDX-1蛋白表达参与葡萄糖毒性作用,引起胰岛素分泌减少,从而在糖尿病的发病机制中发挥作用.     

高糖诱导氧化应激对胰岛细胞功能的影响

目的:研究不同浓度葡萄糖对INS-1细胞及胰岛分泌功能的影响,并探讨氧化应激在葡萄糖对INS-1细胞功能损伤中的作用。方法:将不同浓度葡萄糖(11.1、16.7、22.2、33.3mmol/L)作用于INS-1细胞,镜下观察INS-1细胞的形态改变,应用可见分光光度计测定丙二醛(MDA)含量,运用ELISA方法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。结果:随着葡萄糖浓度的增加,INS-1细胞的凋亡增多,MDA含量逐渐增加,GSIS值逐渐下降,不同浓度葡萄糖组间MDA含量、GSIS值差异有统计学意义(P均<0.01)。结论:高糖可促进INS-1细胞凋亡,在高糖作用下活性氧物质(ROS)代谢产物MDA增多,胰岛细胞胰岛素分泌功能受损。     

Mibefradil抑制高糖诱导的胰岛素分泌作用及其机制的初步研究

目的 初步探讨Mibefradil对高糖作用下胰岛细胞胰岛素分泌的作用及其机制.方法 体外培养大鼠胰岛瘤β细胞株(INS-1),将INS-1细胞分为对照组(11.1 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33.3 mmol/L葡萄糖)、药物组(11.1 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平)、高糖+药物组(33.3 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平),先用不同浓度葡萄糖孵育细胞48 h,再按分组加入药物继续孵育24 h.采用放射免疫法检测细胞培养上清胰岛素含量,RT-PCR及Western blot检测T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达.结果 与对照组相比,高糖组能够明显增加细胞胰岛素分泌(P＜0.05)和胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2基因及蛋白表达(P＜0.05),而药物组胰岛细胞胰岛素分泌水平和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达则与对照组无显著差异(P＞0.05);与高糖组相比,高糖+药物组可不同程度降低INS-1细胞胰岛素分泌,其中Mibefradil组显著降低胰岛素分泌(P＜0.05)和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达(P＜0.05).结论 Mibefradil可能通过下调胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌.     

核转录因子-κB在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用

目的 研究核转录因子(NF-κB)在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用.方法 大鼠胰岛素瘤细胞系(INS-1)细胞以RPMI 1640培养基常规培养.实验分对照组(11.1 mmol/l葡萄糖组)、高糖组(33.3 mmol/l葡萄糖组)、高糖+NF-κB抑制剂组(33.3 mmol/l葡萄糖+NF-κB抑制剂(5 μmol/l)干预组)3组.以荧光定量RT-PCR检测IKKβmRNA水平,Western blot法检测细胞核内NF-κB亚基P65蛋白表达量,Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡率.结果 与对照组相比较,高糖组IKKβ mRNA水平显著升高(P＜0.01),INS-1细胞胞核内P65蛋白表达显著增多(P＜0.01),细胞凋亡率显著升高(P＜0.05).与高糖相比较,高糖+NF-κB抑制剂组IKKβ mRNA水平显著下降(P＜0.01),胞核内P65蛋白表达显著减少(P＜0.01),INS-1细胞凋亡率显著下降(P＜0.05).结论 高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞NF-κB活化,抑制NF-κB活化可有效抑制高糖诱导的INS-1细胞凋亡.     

α-LA干预对INS-1细胞氧化应激的影响

目的:观察α-硫辛酸干预对INS-1细胞的作用及相关机制。方法:先用α-硫辛酸(200μmol/L)加入INS-1细胞中一起培养6 d,再应用不同浓度的葡萄糖作用于INS-1细胞48 h,抽取上清液测定MDA含量,并检测GSIS值,同时应用RT-PCR的方法检测UCP 2基因的表达,并与不加α-硫辛酸组互相比较。结果:(1)在相同糖浓度下,LA干预组与未加LA干预组相比,MDA含量升高,GSIS值降低,各浓度组相比均具有显著性差异;(2)在相同糖浓度下,-αLA干预组与未加-αLA干预组相比,UCP2mRNA表达增强且差异均有显著性。结论:-αLA为一个促氧化剂,能引起MDA含量增加,UCP2mRNA表达增强,GSIS值下降,说明-αLA在较长时间作用于胰岛细胞时起到促氧化的作用。     

大鼠INS-1细胞中IGFBP-2 mRNA的表达调控

目的:研究大鼠胰腺肿瘤β-细胞(INS-1)中,葡萄糖(Glucose)、胰岛素(Insulin)和生长激素(GH)对胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)基因的表达调控,探索IGFBP-2基因调节机制及其在维持正常胰腺细胞生理功能中的作用.方法:RNA印迹法(Northern blotting)检测INS-1细胞IGFBP-2 mRNA的表达,酶标法测定INS-1细胞胰岛素分泌量.结果:葡萄糖对IGFBP-2 mRNA调节作用不同;高浓度(10mmol/L)葡萄糖条件下,胰岛素分泌量增加,而IGFBP-2mRNA表达被抑制;低浓度(1～5.6 mmol/L)葡萄糖条件下,胰岛素分泌量无显著性变化,IGFBP-2 mRNA正常表达.INS-1细胞在不完全培养液中,加入GH培养,在不同时间间隔提取培养液进行IGFBP-2 mRNA检测,结果发现,培养16 h以上,IGFBP-2 mRNA表达开始显著下降.外源胰岛素抑制IGFBP-2 mRNA的表达.结论:葡萄糖和生长激素对INS-1细胞中IGFBP-2 mRNA表达的抑制作用是通过胰岛素调控的.     

VEGF对大鼠胰岛瘤细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响

目的 探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）对大鼠胰岛瘤细胞（INS-1）增殖、凋亡、胰岛素分泌以及相关基因表达的影响。方法 用不同浓度（0、40、80、160 ng/mL)VEGF对大鼠INS-1细胞进行处理,采用CCK-8试剂盒检测INS-1细胞增殖,用Annexin Ⅴ及碘化丙啶(PI)双染试剂检测细胞凋亡;INS-1细胞经VEGF处理后做标准葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验, ELISA法检测胰岛素,实时定量PCR技术检测胰岛分泌过程中相关基因表达,Western blot检测VEGF对Insulin蛋白表达的影响。结果 不同浓度VEGF对INS-1细胞作用24 h、48 h、72 h,其细胞活性均无明显变化（P>0.05）。但当VEGF浓度为80 ng/mL和160 ng/mL时对细胞凋亡具有抑制作用(PSur)、内向整流性钾离子通道基因 (inwardly rectifying potassium channel 6.2, Kir6.2)的表达随VEGF浓度增高呈下降趋势,葡萄糖激酶基因（glucokinase,GCK）的表达先降低后升高,葡萄糖转运蛋白基因2（glucose transporter 2,Glut2）表达呈先升高后降低趋势,Insulin蛋白的表达量随VEGF浓度增高呈逐渐下降趋势。结论 VEGF在高糖状态下对细胞凋亡和胰岛素分泌有抑制作用,为探索VEGF在糖代谢中的作用提供了新的线索。     

PctO2和PctCO2在不同微循环障碍新生儿诊断中的价值及与动脉血气指标的相关性分析

目的探讨经皮氧分压（PctO2）和经皮二氧化碳分压（PctCO2）在不同微循环障碍新生儿诊断中的价值,分析其与PaO2和PaCO2的相关性。方法选择重症新生儿96例,依据毛细血管充盈时间不同,分为微循环正常组36例、轻度微循环障碍组30例和重度微循环障碍组30例。应用经皮氧/二氧化碳分压监测仪测定所有新生儿PctO2和PctCO2,并同步监测PaO2和PaCO2。分析各组患儿PctO2、PctCO2的表达水平有无差异,对PctO2和PaO2、PctCO2和PaCO2进行相关性分析;采用ROC曲线分析PctO2、PctCO2对新生儿缺氧及CO2潴留的早期反应性。结果微循环正常组PctO2和PaO2、PctCO2和PaCO2均呈正相关（r=0.760和0.589,均P＜0.01）;轻度微循环障碍组和重度微循环障碍组PctCO2和PaCO2均呈正相关（r=0.728和0.698,均P＜0.01）,但PctO2和PaO2均无相关性（r=0.316和0.141,均P＞0.05）。3组新生儿PctO2表达均低于PaO2,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;但PctCO2与PaCO2比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。微循环正常组、轻度微循环障碍组和重度微循环障碍组PctO2与PctCO2诊断缺氧和CO2潴留的AUC依次为0.88（P=0.012）和0.65（P=0.112）,0.58（P=0.348）和0.91（P=0.001）,0.62（P=0.152）和0.89（P=0.008）。结论微循环正常新生儿经皮监测PctO2和PctCO2可较好替代PaO2和PaCO2;轻度及重度微循环障碍新生儿PctO2不能较好反映PaO2,此时需结合动脉血气指标综合判断。     

过氧化氢对小鼠脾细胞IL-2基因表达的影响

应用细胞免疫学和分子生物学的斑点杂交技术,探讨Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞产生ＩＬ２和ＩＬ２ｍＲＮＡ表达的影响。结果示１０３～１０－２ｍｏｌ·Ｌ１Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞产生ＩＬ２有抑制作用,并显著低于对照组（Ｐ＜０．０１）;１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１有促进作用（Ｐ＜０．０１）;１０－８～１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１则影响不明显。斑点杂交结果示１０－３ｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞ＩＬ２ｍＲＮＡ表达有抑制作用,１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１有促进作用,而１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１影响不明显。以上结果提示Ｈ２Ｏ２可能是通过影响ＩＬ２ｍＲＮＡ的水平来影响ＩＬ２的产生     

呼吸末二氧化碳监测用于静脉全麻患者的临床观察

目的对呼吸末二氧化碳监测用于静脉全麻患者临床观察。方法随机选择择期行乳腺肿块或区段切除术。年龄在18~45岁。体重40~70 kg。ASAⅠ~Ⅱ级。对40例无呼吸、循环及神经系统疾病的患者进行不同阶段的观察分析。结果所有患者在麻醉过程中SpO2均维持>96%,与麻醉前相比无明显差异。结论采用此种方式监测PetCO2,存在一定的误差,但它具有无创、连续监测的特点,可即时反映通气状态。对于非气管插管保留自主呼吸的患者,用PetCO2结合SpO2监测,能准确、及时地了解患者的呼吸状况,有效的提高静脉全麻患者的安全性。     

聚2，2’－二硫代二苯胺的化学合成与表征

从2-氨基苯硫酚出发制备二硫代二苯胺,以此为原料与重铬酸钠在低温溶液中合成聚二硫代二苯胺,并对产物进行了红外光谱、热重、X射线、光电子能谱和扫描电镜分析表征.     

IGF-2及IGFBP-2与脑神经胶质瘤侵袭能力的相关性分析

目的 探讨IGF-2及IGFBP-2与反映脑神经胶质瘤侵袭能力的MMP-2、TIMP-2相关性.方法 选择到咸阳市中心医院神经外科就诊的86例胶质细胞瘤患者,Ⅰ级30例,Ⅱ级患者25例,Ⅲ级患者20例,Ⅳ级患者11例,对各级患者血清IGF-2、IGFBP-2、MMP-2、TIMP-2进行检测.结果 Ⅱ级患者IGF-2、IGFBP-2较Ⅰ级出现升高,差异有统计学意义(P＜0.05),Ⅲ级患者IGF-2、IGFBP-2较Ⅰ级、Ⅱ级均出现升高,差异有统计学意义(P＜0.05),Ⅳ级患者IGF-2、IGFBP-2较Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级均出现升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅱ级患者MMP-2/TIMP-2较Ⅰ级呈升高,差异有统计学意义(P＜0.05),Ⅲ级患者MMP-2及TIMP-2较Ⅰ级均差异有统计学意义(P＜0.05),MMP-2/TIMP-2较Ⅰ级、Ⅱ级患者均出现升高,差异有统计学意义(P＜0.05),Ⅳ级患者MMP-2及TIMP-2及MMP-2/TIMP-2较Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级均,差异有统计学意义(P＜0.05).IGF-2与TIMP-2、MMP-2/TIMP-2相关 (P＜0.05),IGFBP-2与TIMP-2、MMP-2/TIMP-2相关(P＜0.05).结论 随着神经胶质瘤分级的进展,IGF-2及IGFBP-2水平与脑神经胶质瘤侵袭能力密切相关,是反映神经胶质瘤侵袭能力的重要因子.     

银杏叶总提取物对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用

目的研究银杏叶总提取物(GBE)对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用。方法采用胰酶消化法获取大鼠乳鼠心肌细胞,用H2O2损伤心肌细胞,制备心肌缺血再灌注损伤实验模型,实验组加入GBE使其终质量浓度分别为50、100、150 mg/L,阳性对照组加入异博定,用紫外分光光度法、硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性;测定线粒体中琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(CCO)比活力;透射电镜观察细胞的超微结构。结果与对照组相比模型组LDH活性和MDA水平均明显升高(P<0.05、0.001),SOD则明显降低(P<0.01),而GBE各组能减少LDH和MDA的产生呈剂量依赖关系;SDH和CCO比活力在H2O2组明显下降(P<0.001),GBE组改变不明显;150 mg/L GBE对细胞线粒体有明显的保护作用。结论银杏叶提取物对H2O2诱发的心肌细胞损伤有显著的保护作用,其机制可能与维持细胞中线粒体的能量代谢有关。     

参麦对大鼠肾小管细胞氧化性损伤的影响

目的 :探讨参麦注射液 (SMI)对H2 O2 所致小管细胞氧化性损伤的影响。方法 :通过H2 O2 致鼠肾小管细胞损伤模型建立 ,用组织化学方法显示培养小管细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)。结果 :参麦注射液和辅酶Q1 0 能减轻氧化性损伤肾小管细胞SDH及LDH活性丧失的作用 ,与模型组比有显著差异 (P <0 .0 1 ) ,且对未损伤小管细胞具有明显的保护作用 (P <0 .0 1 )。结论 :SMI对H2 O2 所致的小管细胞氧化性损伤具有明显的修护作用 ,其效应略优于辅酶Q1 0 ,SMI能提高受损小管细胞有氧代谢的功能     

黄芩茎叶总黄酮对培养心肌细胞H2O2损伤超微结构的影响

目的:观察黄芩茎叶总黄酮(SSTF)对H2O2体外致大鼠心肌细胞自由基损伤的保护作用.方法:应用H2O2制作培养大鼠心肌细胞损伤模型,通过透射电镜观察加入SSTF前后心肌细胞超微结构的改变.结果:H2O2损伤组心肌细胞核膜模糊,线粒体嵴紊乱、扩张、溶解成颗粒状,肌丝排列不规则;SSTF保护组核膜平滑规整、部分线粒体已恢复正常,肌丝排列规则.结论:SSTF对培养心肌细胞自由基损伤有保护作用.     

鲜姜有效部位对H2O2致血管内皮细胞ECV-304氧化损伤的保护作用

目的研究鲜姜有效部位对离体培养的血管内皮细胞ECV-304氧化损伤的保护作用。方法取健康大鼠每日ig不同剂量(200、400、800mg/kg)鲜姜有效部位或洛伐他汀(40mg/kg),共4d,取含药血清作为受试药物。采用H2O2建立离体培养的ECV-304细胞氧化应激的损伤模型,测定细胞存活率、内皮细胞培养液中LDH、MDA水平及细胞中MDA水平。结果鲜姜有效部位含药血清能够显著提高H2O2损伤的内皮细胞的存活率,降低受损内皮细胞培养液中LDH,并减少细胞培养液及细胞中MDA。结论鲜姜有效部位具有较强的抗氧化能力及内皮细胞保护作用,可减轻内皮细胞的氧化损伤。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.