生物素—亲和素技术的研究进展

生物素 (biotin,B) -亲和素 (avidin,A)技术 (以下简称 BA技术 )是近几年来发展很迅速的一门生物学技术。其原理基于生物素与亲和素的以下特征 :(1)二者具有高度的特异的亲和性。生物素为小分子物质 ,现已能人工合成。亲和素有卵白素 (又称亲和素 )和链霉亲和素。生物素与 (链霉 )亲和素之间的亲和性 ,至少是抗原 (Ag)抗体 (Ab)间的一万倍以上 ,且不易受外界干扰 ,复合物稳定。 (2 )桥联作用。二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖和酶等生物活性物质 ,同时还能与固相材料结合 ,通过这些特性可将它们偶联起来。 (3)多级放大作用。一个蛋白质 (…     

人类免疫缺陷病毒检测及临床意义

人类免疫缺陷病毒(HIV)检测必须严格按国家制定的《艾滋病检测工作管理办法》和《艾滋病检测技术规范》进行,整个实验过程中应有严格的质量保证体系。做好实验前、中、后的质量控制工作。通过HIV特异性抗体、抗原、核酸及病毒分离检测来确定HIV感染,WHO和我国卫生部推荐使用HIV感染诊断方法,是血清学抗体检测。1HIV抗体初筛检测1.1阿克苏夹心法原理将HIV抗原包被固相载体上,标本中HIV抗体与包被的HIV抗原结合形成复合物,利用抗体的多价性。又与酶(HRP)标记的同类HIV抗原即酶标板内的球状复合物,形成一个HIV抗原抗体酶标记的H…     

HIV-1/2抗体和P24抗原联合检测方法的建立及应用

目的建立HIV-1/2抗体和P24抗原联合检测的酶免疫检测方法,用于HIV感染的实验室诊断,缩短HIV感染的检测窗口期。方法制备抗HIVP24单克隆抗体和多克隆抗体,联合使用基因工程HIV1/2型抗原和抗HIVP24单克隆抗体包被酶联反应板,以辣根过氧化物酶标记的HIV1/2型抗原和生物素化的兔抗HIVP24抗体作为标记物,建立联合检测HIV1/2抗体和P24抗原的ELISA方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行鉴定。结果检测P24抗原质控品的灵敏度可达0.2ng/ml;检测187份HIV阳性血清、210份其他疾病患者血清和520份正常人血清,其敏感性和特异度分别为100%和99.62%。同时重复12次检测4份HIV阳性血清,变异系数均小于10%。结论本方法可以在1.5h内一步同时检出特异性HIV-1/2抗体和HIVP24抗原,缩短了HIV感染的检测窗口期,具备快速、简便、特异、敏感等优点,适用于HIV感染的实验室诊断和流行病学调查。     

链霉亲和素修饰的CdSe–ZnS量子点对聚合酶链反应的影响作用初步研究

目的:探讨链霉亲和素修饰的CdSe–ZnS量子点对聚合酶链反应的影响。方法:将链酶亲和素修饰的量子点浓度进行稀释观察其对于聚合酶链反应体系的浓度效应;反应体系中含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点,在不同的退火温度下进行扩增,观察链酶亲和素修饰的量子点对退火温度的影响;将不同浓度的BSA加入到含有一定浓度的链酶亲和素修饰的量子点的反应体系中,观察BSA的影响作用;将不同公司的Taq酶与不同浓度链酶亲和素修饰的量子点组合,观察对扩增体系的影响。结果:一定浓度链霉亲和素修饰的量子点可以促进聚合酶链反应的扩增效率,拓宽PCR的退火温度范围;BSA可以逆转链霉亲和素修饰的量子点对于PCR的优化作用;量子点可能是与Taq酶相互作用,来影响PCR的扩增效能。结论:一定浓度的链霉亲和素修饰的量子点可以优化PCR的反应体系。     

HIV1/2抗体与P24抗原联合检测的意义研究

目的 研究HIV1/2抗体与P24抗原联合检测对临床诊断的影响.方法 自2006年1月-2011年3月分别收集ELISA法检测HIV1/2抗体吸光度(OD值)为临界值及大于等于阳性对照的患者血清33、29份,采用电化学发光法联合检测HIV1/2抗体与P24抗原(HIVCOM).追踪患者免疫印迹HIV确证试验结果,研究HIV1/2抗体与P24抗原联合检测对临床诊断的影响.结果 33例临界值吸光度患者中27例HIV1/2抗体与P24抗原阳性,6例阴性,29例大于等于阳性对照值吸光度的患者中28例阳性,1例阴性,免疫印迹HIV确证试验的检测结果与联合检测HIV1/2抗体及P24抗原结果一致.结论 HIV1/2抗体与P24抗原联合检测较ELISA法能够更早更准确的发现HIV感染,对临床的与早期诊断和治疗具有重要的意义及应用价值.     

EV71抗原检测方法的建立及初步临床应用

目的建立EV71抗原双抗体夹心检测方法,并初步探讨其在临床血清样品检测中的应用。方法用抗EV71病毒单克隆抗体包被酶联反应板,加入待检标本反应后,用HRP标记的抗EV71病毒单克隆抗体进行检测,建立EV71抗原双抗体夹心检测方法;采用抗人IgM单克隆抗体包被96孔酶联板,辣根酶标记的EV71抗原,建立ELISA捕获方法检测抗EV71-IgM。2种方法同时检测230份体检人员血清,确定方法的cut-off(CO)值,并检测140份手足口病患者血清,采用Graraph Pad Prism 4软件作图并绘制ROC曲线。结果EV71抗原检测方法的CO值为0.168,抗EV71-IgM ELISA检测方法的CO值为0.173。在140例手足口病患者血清中,EV71抗原检测方法的阳性检出率为45.00%,抗EV71-IgM ELISA检测方法的阳性检出率为42.86%,其中共同阳性患者45例,单独EV71抗原阳性患者18例,单独抗EV71-IgM抗体阳性患者15例,如果2种方法联合检测,其阳性检出率可提高到55.71%。结论ELISA检测EV71抗原诊断HFMD具有很好的准确性,结合EV71-IgM抗体捕获检测技术,可进一步提高灵敏度,具有很好的临床应用前景。     

HTNV重组核蛋白及其单抗建立HFRS-MacELISA试剂研究

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂.[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记,在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺一过氧化氢(TMB/H2O2)酶底物系统,从血清中检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体,并与免疫荧光抗体法(IFA)进行比较.[结果]检测用经典免疫荧光抗体法确认的42份阳性血清和42份阴性血清,结果2种试剂检测结果差异无统计学意义.[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgN捕获ELISA诊断试剂可用于肾综合征出血热的早期IgM抗体检测.     

HIV抗体阳性血清梯度稀释系列用于实验室质控和试剂评价探讨

目的探讨HIV抗体阳性血清梯度稀释系列用于实验室质控和试剂评价。方法确认阴性血清梯度稀释HIV抗体确认阳性血清,系列的最高稀释度应含HIV抗体确认实验不确定结果,用第三代双抗原夹心法HIV抗体ELISA检测试剂进行检测,寻找稀释度与OD值间的关系,然后应用于实验室质控和试剂评价。结果在一定稀释度范围内-log[稀释度]与OD值呈线性关系。实验系列用于质控,各实验室均正确报出样品的阴阳性结果,但灵敏度(回归曲线斜率/残差标准差)不同,依此对实验室进行排序;同时,没能正确报出检测结果的试剂其确定系数和灵敏度较底。结论HIV抗体阳性血清梯度稀释系列可用于实验室质控和试剂评价。但灵敏度的合适范围还需继续探讨。     

汉坦病毒核蛋白及其单抗标记物在建立ELISA试剂中的应用

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂。[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记，在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺-过氧化氢（TMB／H2O2）酶底物系统，从血清中检测肾综合征出廊热早期特异性IgM抗体，并与免疫荧光抗体法（IFA）进行比较。[结论]检测42份可疑HFRS病人血清，ELISA法和IFA法均阳性的20份，均阴性的19份；ELISA法阴性、IFA法阳性的1份，ELISA法阳性、IFA法阴性的2份，2种方法的差异无统计学意义（配对x^2=0．08，P〉0．05）。[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂可用于HFRS的早期IgM抗体检测。     

尿液HIV 1抗体检测及其临床意义 FREE

目的探讨尿液标本中人免疫缺陷病毒（HIV） 1抗体检测的临床意义。方法应用酶联免疫吸附试验（ELISA）对59例经疾病预防控制中心（CDC）确诊的HIV感染者及30例健康体检者血液和尿液标本同时进行HIV 1抗体检测;以确认结果为准,计算尿液HIV 1抗体检测的敏感度、特异度。结果59例经CDC确诊的HIV感染者血清HIV 1抗体全部阳性,相应尿液中HIV 1抗体阳性53例,阴性6例;对照组30例的血清HIV 1抗体全部阴性,相应尿液1例HIV 1抗体阳性,经血清ELISA法及胶体硒法对该样本进行HIV 1抗体检测均阴性。以确认结果为准,尿液HIV 1抗体检测阳性敏感度为89.83%,特异度为96.67%。结论在采集血液标本不便的情况下,可通过检测尿液HIV 1抗体对高危人群进行HIV感染筛查。     

酶标一步法试剂检测HIV抗体的前滞现象分析

目的：探讨酶标一步法试剂检测HIV抗体的前滞现象（钩状效应）及其应对措施。方法：对高危人群的血清标本采用一步法和两步法及稀释法进行检测,3种方法任何一种检出阳性的样品均做WB确认试验确证。结果：抗-HIV采用酶标一步法检测时出现假阴性现象,漏检率达0.75%。结论：酶标一步法试剂的HOOK现象可导致HIV抗体检测的假阴性,造成漏检,最好的解决办法是采用二步法或稀释法。     

人巨细胞病毒ELISAIgG法试剂盒特异性的核查和应用

采取PBS-冻融、超声法制备HCMV ELISA抗原测人血清特异IgG抗体。经用人巨细胞病毒特异抗原和其他病毒抗原作特异性抑制试验,HCMV抗原能抑制同一份阳性血清的OD值达80％以上,其他病毒抗原无抑制作用。参照日本提供的HCMV-IgG阳性和阴性血清,证实本实验的系统重复性好。本方法使用一定浓度的抗原量和定最的抗人IgG酶结合物,可检测到满意的抗体效价,且本底低。用本试剂检测62份正常产妇脐血清和45份普通门诊成人血清,其阳性率分别为98.4％和93.3％。     

3种进口第四代人类免疫缺陷病毒检测试剂检测性能评价

目的通过对比分析3种进口第四代人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原抗体诊断试剂检测HIV抗体和P24抗原的特异性及敏感性,评价这3种HIV检测试剂在临床实际应用中的意义。方法用HIV抗体阴性样品1 075份、HIV抗体阳性样品164份、BBI阳转血清盘(PRB92901-07)和7种不同稀释度的P24抗原阳性对照血清等,对3种进口第四代HIV检测试剂的敏感性和特异性进行分析。结果方法1、2、3检测HIV抗体特异性分别为92.9%、99.4%和99.3%,经统计处理,方法2特异性高于方法1,差异有统计学意义(χ2=59.7,P<0.01),方法3特异性高于方法1,差异有统计学意义(χ2=57.3,P<0.01),方法2和方法3特异性差异无统计学意义;3种试剂检测HIV抗体的敏感性一致,皆为100.0%;但其检测P24抗原的敏感性不同,方法3检测P24抗原的敏感性最高,可检出最高稀释度为1∶32的P24抗原阳性对照血清;而方法1和方法2检测P24抗原敏感性较低,只能检出最高稀释度为1∶16的P24抗原阳性对照血清;3种试剂检测BBI阳转血清盘AD第18天的HIV抗体检测结果为阳性,而第三代HIV抗体检测试剂检测血清盘第21天的HIV抗体检测结果为阳性。结论 3种进口第四代抗原抗体检测试剂敏感性均高于第三代检测试剂,能检出HIV感染窗口期的样品;3种试剂检测HIV抗体的敏感性一致,但检测P24抗原的敏感性和HIV抗体的特异性不一致,方法1检测HIV抗体的特异性较低,而方法3检测P24抗原的敏感性最高。     

3种登革热抗原检测方法的比较

目的比较3种检测方法——免疫胶体金包被法、ELISA检测法及PCR核酸检测法,测定登革热抗原的敏感性、特异性及其3种方法的优缺点。方法用免疫胶体金包被法和ELISA检测法及PCR核酸检测法,对来源于医院临床诊断的疑似登革热病例的血清进行抗原检测。结果 100份临床诊断疑似登革热病例的血清经过免疫胶体金包被法检测为阳性者再次用ELISA检测法及PCR核酸检测法测定抗原,检测后的阳性结果准确率均为100%,而100份免疫胶体金包被法检测为阴性的血清,用ELISA检测法及PCR核酸检测法测定抗原,结果出现了假阴性。结论通过比较免疫胶体金包被法、ELISA检测法及PCR核酸检测法检测登革热抗原,使用ELISA检测法及PCR核酸检测法测定登革热抗原的敏感性较强,准确度很高并具有可排除干扰因素的优点。     

酶联免疫吸附法的质量控制

酶联免疫吸附法(ELISA)已被广泛应用,但由于使用的药盒产地不一,药盒的质量、组成、操作方法也不一致,难以准确判断检测结果,我们针对这一问题,在使用国产ELISA 药盒时建立了实验室内质量控制,初步取得了满意效果。现以HBsAg 检测为例介绍如下。1 器材与试剂的要求器材必须洁净,每批聚苯乙烯板孔要进行质量检查,各孔吸附抗原性能要求均一性好,OD 值变异系数在10%以下。阴性和阳性结果要有明显差异。阳性和阴性参比血清(P/N)的OD 值差异在10倍以上。移液器的精度应小于±2%。ELISA 药盒要按规定运输和存放,在有效期内使用,每次使用时以阳性参比血清检查     

黔南地区122例HIV抗体初筛检测阳性标本复检及确认结果分析

[目的]分析黔南州12县(市)疾控中心HIV初筛实验室检测HIV阳性的标本复检及确认情况.[方法]酶联免疫双抗原夹心法.州疾控中心HIV初筛实验室将各县(市)送检阳性标本用两种试剂复检后,对复检仍为阳性的样品再送贵州省疾控中心艾防所确认.[结果]各县市HIV实验室初筛122例阳性样本经黔南州疾控中心HIV实验室复检为107例阳性,15例阴性,阳性符合率为87.7%;黔南州疾控中心HIV中心实验室复检107例阳性样本送贵州省疾控中心艾防所确认为104例阳性,3例阴性,阳性符合率为97.2%;各县市HIV实验室初筛122例阳性样本经省艾防所最终确认阳性符合率为85.20%.[结论]各HIV初筛实验室检测结果准确度不够理想,应采取综合措施提高县市基层HIV初筛实验室检测水平.     

第四代HIV抗原抗体检测试剂在血液筛查中的应用

目的研究第四代HIV抗原抗体检测试剂在血液筛查中的应用价值。方法对第四代HIV抗原抗体检测试剂进行灵敏度和重复性实验;分别采用第三代HIV抗体检测试剂和第四代HIV抗原抗体检测试剂对血液样本进行初复检,对第三代试剂检测阴性第四代试剂检测阳性的样本采用HIV核酸检测方法进行确认。结果第四代HIV抗原抗体检测试剂最低抗原检出浓度为1.25 U/mL,孔间精密度为3.2%;2009年10月²011年3月,共筛查样本23 480例,其中13例第三代试剂结果阴性而第四代试剂结果阳性,经HIV核酸检测的方法进行确认,全部结果均为阴性。结论在血液筛查中引入第四代HIV检测试剂的试剂功效尚待进一步验证,在已经广泛开展HIV抗体检测的基础上,引入第四代HIV抗原抗体检测试剂还是引入核酸检测具有更好的成本效益比,是一个值得待探讨的课题。     

血清抗结核抗体在肺结核诊断中的意义

肺结核病的早期诊断是发现病人控制病情的关键,现有的诊断方法对发现病人确定诊断均欠理想.本文应用ELISA法,以PPD抗原测定血中结核分枝杆菌的lgG抗体,以期评价血清结核抗体测定在肺结核诊断中的意义.一、材料和方法试剂盒由温州伊利康生物制品有限公司提供.以PPD抗原作为包被物,羊抗人IgG为酶标抗体进行ELISA法,用美国DYNATECH MR 5000酶标仪测OD值>100为阳性.     

结核分枝杆菌4种分泌蛋白血清学应用价值

目的通过对4种基因重组的结核分枝杆菌分泌蛋白进行包被,建立了酶联免疫检测方法,用于检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者、卡介苗接种者的血清抗体,并探讨结核分枝杆菌分泌蛋白的血清学应用价值。方法在酶标板上分别包被基因重组蛋白ESAT-6、Ag85A、MPT64、MPT81抗原,建立间接ELISA方法,分别检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者和卡介苗接种前后的血清抗体。结果肺结核组血清抗体除ESAT-6外,Ag85A、MPT64、MPT81的阳性率均显著高于非结核肺部疾病组(P0.01)。结核菌素试验阴性者注射上述卡介苗前阳性率分别为19.0%、13.8%、12.1%、12.1%,注射后阳性率分别为37.9%、24.1%、15.5%、17.2%,其中注射ESAT-6前后阳性率之间的差异有显著性(P0.05)。结论用结核分枝杆菌重组分泌蛋白检测结核病人血清抗体具有重要的诊断价值,有望作为结核蛋白芯片的候选抗原。     

HCV抗原ABS-ELISA检测方法的建立及初步评价

目的 建立新的HCV抗原生物素-亲和素-酶联免疫检测方法(ABS-ELISA).方法 将生物素-亲和素系统与酶联免疫技术相结合,建立用于丙型肝炎病毒抗原检测的方法,分析检测方法的灵敏度、特异度、稳定性及精确度等主要技术指标,并对应用效果进行评价.结果 建立的检测方法,对40余种肠道病毒样品均无交叉反应,在第二代HCV-RNA国家标准品的10份阴性标准品中,未检出HCV-Ag阳性样品,在10份HCV-RNA阳性标准品中,检出6份HCV-Ag阳性的样品,表现出良好的特异性；检测试剂CV平均值为6.28％,精密性好；在90份HCV抗体阳性样品中检测出HCV-RNA样品67份(74.44％),检出HCV游离抗原阳性样品30份(33.33％)、HCV总抗原阳性样品68份(75.56％),HCV游离抗原与HCV-RNA两个指标检出率差异有统计学意义(x2=22.443,P＜0.01),但HCV总抗原与HCV-RNA检测结果之间差异无统计学意义(x2=0.037,P＞0.05)；以HCV-RNA检测试剂为金标准,所建立的ABS-HCV抗原检测试剂总抗原检测结果的一致性、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为98.03％、80.60％、98.93％、79.41％、99.00％.结论 新建立的HCV抗原ABS-ELISA检测方法特异性好,其灵敏度与荧光定量PCR相近.