血管抑素基因转染抑制胆囊癌细胞的实验研究

目的:观察血管抑素基因转染对体外人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞株增殖及血管抑素表达和裸鼠致瘤体积的影响,初步探讨血管抑素基因转染抑制胆囊癌细胞生长的可能性.方法:应用pcDNA3.1( )-angiostatin 基因转染GBC-SD胆囊癌细胞.观察细胞生长情况,制作细胞生长曲线;Western-blot法分析血管抑素的表达情况;裸鼠种植瘤模型观察肿瘤的体积和质量.结果:pcDNA3.1( )-angiostatin 基因转染的GBC-SD胆囊癌细胞生长明显受到抑制,血管抑素的蛋白表达也明显增加.转染的肿瘤细胞在裸鼠种植瘤明显小于阴性组和空白组.结论:血管抑素基因转染可能具有抑制胆囊癌细胞增殖及生长的作用.     

转染hEndostatin基因对CNE2细胞株裸鼠移植瘤生长的影响

背景与目的：肿瘤的生长、转移是血管生成依赖性的,血管生成抑制剂有望通过抑制肿瘤血管生成及诱导肿瘤细胞凋亡,有效地抑制肿瘤的生长和转移。本文旨在探讨转染人内皮抑素基因hEndostatin对人鼻咽癌细胞株CNE2裸鼠移植瘤生长的影响。方法：采用脂质体介导法,分别将pBlast-hIL-hEndostatin、pBlast-hEndostatin和pBlast-MCS质粒导入人鼻咽癌细胞株CNE2,MTT法在体外检测转导细胞表达的hEndostatin的活性,并在体内实验中观察转导的CNE2细胞在裸鼠上的致瘤性的差异。结果：转染pBlast-hIL-hEndostatin的CNE2细胞的上清能显著抑制血管内皮细胞ECV304的生长,其在裸鼠体内形成的瘤组织重量和体积均显著低于对照组（P＜0．01）,生长速度明显慢于对照组细胞。结论：转染hEndostatin基因能有效抑制CNE2细胞在裸鼠体内的生长。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

内皮抑素基因对裸鼠移植骨肉瘤的抑制作用

目的：探讨内皮抑素（endostatin,ES）基因对裸鼠骨肉瘤细胞UMR106移植瘤的抑制作用。方法：携带ES基因重组质粒体外扩增后,应用脂质体法转染骨肉瘤细胞UMR106,Zeocin抗性筛选得到ES-UMR106细胞。MTT法观察ES基因对肿瘤细胞增殖的影响,ELISA法检测转染后肿瘤细胞的ES分泌情况。MTT法观察ES基因对血管内皮细胞增殖能力的影响。应用ES-UMR106和UMR106细胞制作裸鼠皮下移植瘤模型,观察两组动物移植瘤生长情况、瘤组织的病理变化及肺转移的情况。结果：ES基因转染不影响UMR106细胞的增殖能力;ES-UMR106细胞可表达有生物活性的ES,转染后48hES在培养液中超过350ng/ml。ES-UMR106细胞分泌的ES可明显抑制血管内皮细胞增殖。与UMR106细胞相比,ES-UMR106细胞在裸鼠接种的移植瘤生长速度缓慢、包膜完整,病理组织学显示瘤体内血管稀少,肿瘤细胞广泛坏死;UMR106细胞移植瘤裸鼠肺组织出现转移灶（2/8）,ES-UMR106细胞移植瘤裸鼠无肺转移灶。结论：携带ES基因重组质粒转染骨肉瘤UMR106细胞后可抑制该骨肉瘤细胞移植瘤的生长和转移。     

转染KISS-1对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的 影响

 目的 探讨KISS-1基因对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的影响。 方法 通过脂质体介导将pcDNA3.1-KISS-1转染人食管鳞癌细胞EC-1,用Western blot法检测转染前、后KISS-1蛋白的表达。将单纯EC-1细胞、稳定转染空质粒的EC-1细胞、稳定转染pcDNA3.1-KISS-1的EC-1分别接种于BALB/c-nude裸鼠,构建裸鼠食管鳞癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情 况,测量肿瘤体积和瘤质量并绘制肿瘤生长曲线;免疫组织化学和半定量RT-PCR技术检测肿瘤组织中KISS-1蛋白和mRNA的表达。 结果 KISS-1基因转入食管鳞癌EC-1细胞,KISS-1蛋白的表达（1.143±0.218）较空质粒转染组（0.745±0.130）和对照组（0.855±0.184）明显增加（P<0.05）,转染KISS-1基因组裸鼠较空质粒转染组和对照组肿瘤生长速度慢,体积（949.42±102.26）mm3与空质粒转染组（1339.82±72.23）mm3和对照组（1384.04±97.07）mm3相比明显减小（P<0.05）,瘤体重量（0.498±0.654）g与空质粒转染组（0.638±0.066）g和对照组（0.676±0.108）g相比明显减轻（P<0.05）。 结论 通过基因转染的方法能表达有活性的KISS-1,并能抑制裸鼠食管癌移植瘤的生长。     

雷帕霉素抑制胆囊癌GBC-SD细胞的生长和转移

目的：研究雷帕霉素 (rapamycin) 对胆囊癌GBCSD细胞生长和转移的影响,探讨雷帕霉素治疗胆囊癌的临床应用前景。方法:采用MTT法检测不同浓度（12.5、25、50 nmol/L）的雷帕霉素对胆囊癌细胞增殖的影响,以流式细胞术检测不同浓度的雷帕霉素对细胞凋亡和细胞周期的变化,Transwell小室检测雷帕霉素对细胞迁移能力的影响,利用Western blotting检测胆囊癌细胞中雷帕霉素哺乳动物靶标（mammalian target of rapamycin,mTOR）及其磷酸化pmTOR水平。结果:雷帕霉素可显著抑制胆囊癌GBCSD细胞中mTOR的磷酸化,但对mTOR表达无影响。雷帕霉素显著抑制胆囊癌细胞的生长,并呈剂量依赖性抑制(P<0.01)。雷帕霉素可引起胆囊癌细胞周期G1/S阻滞和细胞凋亡;可显著抑制胆囊癌细胞的转移(P<001)。结论:雷帕霉素能显著抑制胆囊癌细胞生长及转移,其机制可能与抑制pmTOR通路、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。     

Lewis y高表达对人卵巢癌RMG-I细胞裸鼠体内致瘤性及移植瘤VEGF和VEGFR表达的影响

目的：比较α1,2岩藻糖转移酶基因转染前后卵巢癌细胞株RMG-I的裸鼠体内致瘤性及移植瘤组织血管内皮生长因子及其受体VEGFR1和VEGFR2表达的变化。方法：利用已建立的Lewisy抗原稳定高表达卵巢癌细胞株RMG-I-H及转染前细胞株RMG-I为细胞模型,将转染前后细胞株种植裸鼠皮下建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,观察两组肿瘤生长情况。第5周处死动物,测量移植瘤重量,免疫组织化学方法检测肿瘤组织VEGF及VEGFR1、VEGFR2的表达。结果：转染组及未转染组裸鼠均有荷瘤形成,但转染组的成瘤时间（5.2±0.8d）早于未转染组（8.8±1.3d）,且转染组的瘤重和体积与未转染组相比均明显增加（P〈0.05）。转染组裸鼠移植瘤组织VEGF及VEGFR2表达量明显高于未转染组（P均〈0.05）。结论：Lewisy抗原高表达能增加卵巢癌RMG-I细胞的体内致瘤性,上调裸鼠移植瘤VEGF及VEGFR2的表达。提示Lewisy抗原能提高癌细胞的恶性程度,且该作用与VEGF及VEGFR2表达增高关系密切。     

KiSS-1基因的表达对裸鼠子宫内膜癌皮下种植瘤的影响

目的探讨KiSS-1对子宫内膜癌转移抑制的效果及基因转染的方法和途径。方法将裸鼠分为对照组、空质粒转染组(空质粒与HEC-1B细胞同时注入裸鼠皮下)及KiSS-1质粒转染组(基因质粒与HEC-1B细胞同时注入裸鼠皮下)3组。成瘤后从解剖及组织学角度观察各组皮下瘤及转移瘤的体积和数量变化,从分子生物学水平检测pcDNA3.0-KiSS-1质粒在活体组织中的转染效果及表达水平,分析KiSS-1基因对肿瘤组织细胞侵袭转移能力的影响。结果用子宫内膜癌细胞株建立裸鼠皮下移植瘤是可行的,成瘤率为86%。KiSS-1质粒转染组较对照组及空转染组肿瘤细胞的KiSS-1mRNA表达明显增强,P=0.006。MMP-9mRNA表达明显减弱,P<0.05。实验组中肿瘤细胞KiSS-1mRNA的表达强度与转染pcDNA3.0-KiSS-1质粒的剂量有明确关系,P=0.05。结论建立子宫内膜癌裸鼠皮下种植瘤动物模型方法简单,成功率高,易于观察。KiSS-1基因体内转染方法可行,对细胞生物学影响与转染剂量有明确关系。KiSS-1基因可能是子宫内膜癌基因治疗的一个有前景基因。     

NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的：探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响,探索胃癌基因治疗新方法。方法：构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,观察双层软琼脂集落形成能力及转染前后生长曲线的变化。电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变。结果：氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达降低,细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强,裸鼠成瘤能力下降。结论：NHE1反义基因磁性纳米微粒能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHE1蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用,NHE1基因可能成为基因治疗胃癌的一个理想靶点。     

腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染对肝细胞性肝癌生长的抑制作用

目的　研究腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染对肝细胞性肝癌的抑制作用。方法　用含人内皮抑素的腺相关病毒(r AAV2 /EGFP- Endo)转染肝癌细胞Hep3B,通过流式细胞仪检测其转染率。MTT法检测转染细胞的培养液上清对人脐静脉内皮细胞ECV30 4增生的抑制作用。Hep3B细胞接种裸鼠建立移植瘤模型,分别瘤内注射r AAV2 /EGFP- Endo(2×10 1 0 v.g.)、r AAV2 /EGFP或生理盐水,3周后检测裸鼠血液中内皮抑素的表达及移植瘤的体积和微血管密度(MVD)。结果　流式细胞仪结果显示重组腺相关病毒体外对Hep3B细胞的转染率为6 2 .5 % ;转染内皮抑素基因的Hep3B细胞的培养液上清能显著抑制ECV30 4细胞的生长(P<0 .0 1)。移植瘤内注射r AAV2 /EGFP- Endo后,荷瘤裸鼠血清中内皮抑素浓度为(82 .6 4±7.5 4 ) μg/L,移植瘤的体积和微血管密度均明显低于对照组(P<0 .0 1)。结论　腺相关病毒介导的人内皮抑素基因转染能够有效抑制人肝细胞性肝癌的生长。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

高表达CypA肝癌细胞系的建立及其功能初步研究

目的：构建含人全长CypA cDNA的真核表达质粒,建立高表达CypA蛋白的肝癌细胞系,为进一步研究CypA在肝癌中的功能和作用机制提供细胞模型。方法：将人全长CypA cDNA序列克隆后,连接至真核表达载体pcDNA3.1中,再将构建的真核表达载体转染至FHCC98肝癌细胞中,经G418加压筛选后获得稳定表达CypA的肝癌细胞株;免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况;MTT法测定细胞的增殖速率。结果：真核表达载体pcDNA3.1-CypA经酶切、测序鉴定,结果正确;免疫印迹结果显示,稳定转染后细胞的CypA表达水平显著高于空载体转染和未转染的细胞;与对照相比,稳定高表达CypA的细胞增殖速度加快。结论：成功构建了含有人全长CypA cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1-CypA;建立了稳定高表达CypA的FHCC-98肝癌细胞系;CypA的高表达可以促进FHCC98细胞的增殖。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的：构建fascin基因的pcDNA3.1（＋）表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白（F-actin）的变化。方法：应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1（＋）重组,获得重组表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果：成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1（＋）载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1（＋）-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论：成功构建了pcDNA3.1（＋）-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

重组人 ZNF278 促进胃癌细胞系 SGC7901 增殖的研究

目的：构建pcDNA3．1-ZNF278重组人真核表达质粒,研究ZNF278对胃癌细胞增殖和周期的影响。方法：PCR扩增正常人胃黏膜组织中的ZNF278基因,并用EcoRI和HindIlI双酶切,与酶切后的pcDNA3．1-myc—his载体连接,转化DH50t大肠杆菌,克隆筛选,提取重组质粒,酶切鉴定并测序。重组人ZNF278真核表达质粒转染胃癌细胞系SGC7901,定量PCR和Westernblot技术检测ZNF278表达状况,利用MTr和细胞记数法检测细胞增殖,同时分析细胞周期变化。结果：测序证实pcDNA3．1-ZNF278真核表达质粒构建成功,并成功转染SGC7901细胞,检测确认ZNF278表达上调,转染重组pcDNA3．1-ZNF278质粒的SGC7901细胞较对照组生长加快,促进细胞周期进入s期。结论：pcDNA3．1-ZNF278重组质粒构建成功,并可促进胃癌细胞系SGC7901细胞增殖和细胞进入分裂期。     

Inhibition of tumor growth correlates with the expression level of a human angiostatin transgene in transfected B16F10 melanoma cells

Although the therapeutic value of angiostatin, a proteolytic fragment of plasminogen, has been recognized for the treatment of cancer, the production of bioactive angiostatin remains a difficult task. Here we report that expression of a cDNA encoding a secreted, four-kringle human angiostatin inhibited tumor growth of B16F10 melanoma cells in mice but did not suppress tumor cell growth in culture. After transfection and selection, stable expression of the angiostatin cDNA was demonstrated in several B16F10 clones by quantitative mRNA analysis using the Taqman method. Cells that expressed angiostatin at either a low, medium, or high level were injected into C57BL/6 mice. s.c. Growth of B16F10 tumors was diminished by the angiostatin transgene, and the inhibition was directly proportional to the expression level of angiostatin in the transfected cells. However, suppression of s.c. tumor growth was transient, and eventually, tumors emerged with a strongly decreased expression of the transgene. Angiostatin expression also reduced lung metastasis from i.v.-injected B16F10 cells. Our data indicate that a cDNA encoding bioactive human angiostatin is potentially useful for gene therapy of human cancers, but the delivery of the transgene may require repeated dosing to achieve sustained dormancy of primary tumors and cancer metastases.     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

PTEN 表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706

 目的 筛选稳定表达野生型PTEN基因的食管鳞癌细胞株EC9706。方法 提取胎盘总RNA，设计引物，PCR扩增人野生型PTEN基因，经测序鉴定后，连接于pcDNA3．1（＋）真核表达载体，构建pcDNA3．1-PTEN，用脂质体介导的方法将其转染EC9706。而后加抗生素G418筛选稳定表达株，用RT-PCR方法检测稳定表达株PTEN基因的mRNA水平，通过绘制生长曲线观察细胞生长情况。结果 PCR产物的电泳结果显示，在1500bp左右有一明显亮带，测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致；稳定表达PTEN基因的细胞株RT-PCR结果显示，PTEN的mRNA水平比对照细胞株相比明显升高；生长曲线结果显示，转染后的细胞生长速度明显减慢。结论 所扩基因为野生型PTEN基因，所构建的载体为野生型PTEN基因真核表达载体，并筛选出PTEN基因稳定表达的食管鳞癌细胞株。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

FRNK对人乳腺癌MDA-MB-435细胞迁移的抑制作用

背景与目的:粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)的高表达或过度激活与肿瘤迁移密切相关。粘着斑相关非激酶(FAKrelatednon-kinase,FRNK)是FAK内源性抑制剂,通过与FAK竞争粘着斑结合位点抑制FAK活性。本研究旨在探讨FRNK对人乳腺癌细胞MDA-MB-435迁移的抑制作用及相关机制。方法:RT-PCR法克隆目的基因FRNK,构建pcDNA3.1-FRNK重组质粒;利用脂质体转染MDA-MB-435细胞,经G418筛选抗性单细胞克隆,通过Westernblot鉴定稳定高表达FRNK蛋白的MDA-MB-435细胞并检测其与野生型MDA-MB-435细胞中基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase9,MMP-9)表达水平;采用体外划痕修复实验和Boyden趋化小室比较野生型和稳定高表达FRNK蛋白的MDA-MB-435细胞的非定向及定向迁移运动能力。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-FRNK,建立稳定高表达FRNK蛋白的MDA-MB-435细胞。高表达FRNK的细胞较野生型MDA-MB-435细胞MMP-9蛋白表达降低73.1%。在划痕修复实验中,稳定高表达FRNK蛋白的MDA-MB-435细胞移行面积与空白面积之比为0.35±0.02,与野生型MDA-MB-435细胞(0.58±0.06)相比划痕修复能力明显减弱(P<0.05);在趋化小室实验中,高表达FRNK蛋白的MDA-MB-435细胞迁移数为65.15±8.56,仅为野生型MDA-MB-435细胞迁移数(97.86±5.44)的66.57%。结论:FRNK可抑制MDA-MB-435细胞迁移运动,该抑制作用与MDA-MB-435细胞中MMP-9表达下调有关。