小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

携带小鼠RORγt基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293FT细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208,生成pXZ9-RORγt。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,以Western blot鉴定RORγt的表达。结果表明,RT-PCR扩增出RORγt基因并克隆入PCR2.1T载体;经亚克隆构建了慢病毒转移质粒XZ9-RORγt。质粒经脂质体转染293FT细胞获慢病毒颗粒,慢病毒颗粒体外高效感染293FT细胞,感染后Western blot检测到RORγt蛋白表达。结论：成功构建慢病毒载体pXZ9-RORγt,并在293细胞内获得表达。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化.目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成.材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6N5一DEST,ccdB Survival,Stb13及293FT细胞由暨南大学生物工稃研究所提供.方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221一hTERT-EGFP.采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5一DEST-hTERT-EGFP.将PLenti6N5一DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞.主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功.包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况.结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP成功构建.转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法.     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-Fu-Shh的测序,Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合,判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP—ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS--EF1-copGFP—ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染人人前列腺癌细胞。     

携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建

目的构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础。方法对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上。选取hHGF正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,挑取阳性克隆行PCR及酶切鉴定。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR及WesternBlot方法检测hHGF的表达。结果目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致。hHGF基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGFmRNA和蛋白的表达。结论成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF的生物学功能提供了实验依据。     

利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系

目的：利用重组慢病毒载体将绿色荧光蛋白基因（GFP）导入293T细胞,建立稳定表达GFP的细胞系,将GFP作为靶基因观察不同方法调节基因表达的效力的差异。方法：以载体质粒pHR＇-pCMV-GFP、包装质粒pCMV-ΔR8.2及包膜质粒pCMV-VSVG用磷酸钙共沉淀法共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒再次感染293T细胞,用克隆环筛选出荧光亮度较强的细胞克隆。多次传代后,流式细胞术检测细胞荧光表达的稳定性。同时进行靶向GFP的RNA干扰,观察GFP表达下调情况,验证该细胞系用于研究基因调控方法的有效性。结果：利用重组慢病毒载体可有效建立GFP稳定表达的新细胞系,此细胞系中GFP阳性细胞占99%以上,12次传代前后GFP表达无明显差异;靶向GFP的RNAi可以显著下调GFP表达。结论：成功建立了表达GFP的G4细胞系,并可有效地用于基因调节方法的研究。     

沉默Tiam1基因对大肠癌LoVo细胞上皮-间质转化的影响

目的:探讨RNAi技术沉默Tiam1对大肠癌LoVo细胞上皮-间质转化(EMT)的影响.方法:应用RNAi技术将Tiam1的特异性干扰片段转染处理LoVo细胞,采用Real time-RT PCR方法检测Tiam1表达水平和沉默前后LoVo细胞E-cadherin、Vimentin、RhoA、RhoC、Rac1的表达水平;扫描电镜、透射电镜,HE染色观察细胞结构及形态变化;考马斯亮蓝染色观察细胞骨架变化.结果:与对照组比较,RNAi组的Tiam1 mRNA表达水平明显降低;RNAi组的E-cadherin mRNA表达水平比对照组上调,差异具有统计学意义(P ＜ 0.05),RNAi组Vimentin、RhoA、RhoC、Rac1的mRNA表达水平与对照组比较差异均无显著性(全部P ＞ 0.05);扫描电镜显示RNAi组细胞胞体比对照组变圆、细胞突起明显变短或消失,丝状微绒毛减少,变为扁平盘状突起;透射电镜显示RNAi组细胞表面丝状微绒毛比对照组有较明显减少;HE染色显示对照组细胞散在生长,呈细长梭形,RNAi组细胞生长较集中,呈圆形或类圆形;RNAi组细胞质中丝网状的骨架蛋白结构及点状肌动蛋白小体比对照组减少.结论:沉默Tiam1能在一定程度上使已发生EMT的大肠癌细胞出现上皮表型及降低其迁移运动能力,对EMT有一定程度的逆转作用,推测Tiam1通过诱导EMT来促进大肠癌侵袭、转移,至于其确切机制尚待进一步研究.     

Tiam1和Rac1在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义

目的观察骨肉瘤组织中Tiam1和Rac1的表达与临床病理的关系,探讨Tiaml和Rac1细胞信号分子可能参与骨肉瘤侵袭转移过程的机制。方法采用免疫组织化学S-P法检测60例骨肉瘤标本肿瘤组织与瘤旁正常骨组织中Tiaml和Rac1的表达,并探讨其表达与临床指标的关系,以及两分子标志物之间的相互关系。结果 （1）骨肉瘤瘤旁正常骨组织Tiaml和Rac1表达显著低于骨肉瘤组,两者差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）Tiaml和Rac1与患者的年龄、性别以及组织类型、发生部位均无关（P〉0.05）,而和Enneking分期指标之间的差异比较则显示具有统计学意义（P〈0.05）。（3）通过相关分析,Tiaml和Rac1之间相关（P〈0.01）。结论 Tiaml和Rac1在骨肉瘤的恶性表型及侵袭和转移中起促进作用,他们的表达同Enneking分期呈正相关。     

人脑星形细胞瘤中Wiskott-Aldrich综合征蛋白质与T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1蛋白表达的意义

目的探讨不同病理学级别人脑星形细胞瘤中Rho GTPases相关信号通路蛋白Wis-kott-Aldrich综合征蛋白质(WASP)与T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)所扮演的可能角色。方法应用免疫组织化学法检测60例不同病理级别人脑星形细胞瘤组织中WASP、Tiam1蛋白表达,评估其与星形细胞瘤的病理分级及临床特征的关系。结果 (1)Tiam1蛋白高级别组的阳性率和高表达率均高于瘤旁脑组织和低级别组(P<0.05),且Tiam1蛋白的阳性率和高表达率有从瘤旁脑组织→低级别星形细胞瘤→高级别星形细胞瘤递增的趋势,Tiam1表达的强弱在一定程度上反映了人脑星形细胞瘤的恶性程度。(2)Tiam1蛋白表达的阳性率和高表达率与年龄、性别、部位及肿瘤最大径无关(P>0.05)。(3)WASP蛋白为阴性表达。结论 WASP蛋白与星形细胞瘤发生和进展的相关性不明确;Tiam1蛋白在了解星形细胞瘤恶性进展方面有参考价值,且可能是有预后价值因子之一。     

Tiam1在肺癌及正常肺组织中的表达规律及其临床意义

目的:从蛋白水平探讨T淋巴瘤侵袭和转移诱导因子1(Tiam1)与肺癌的关系,分析其在肺癌形成、发展和转移中的意义。方法:采用免疫组化和图像分析技术检测由102例肺癌组织、20例正常成人肺组织、20例胎儿肺组织构成的760点阵的石蜡组织芯片中Tiam1蛋白表达强度的阳性单位(PU值),定量分析Tiam1在正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞、人胚胎肺泡上皮细胞、肺癌原发灶和淋巴结转移灶中的表达差异。结果:肺癌细胞Tiam1阳性单位PU值(12.51±4.62)显著大于正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞的PU值(5.66±1.29)及胚胎肺泡上皮细胞的PU值(5.87±0.99,F=41.251),(P=0.000);有淋巴结转移组Tiam1的PU值(14.33±4.66)大于无淋巴结转移组(11.13±4.11,t=3.674),(P=0.000);TNM分期TNMⅢ～Ⅳ期Tiam1的PU值(15.11±3.61)大于TNMⅠ～Ⅱ期(11.95±4.63,t=2.72),(P=0.008);肺癌Tiam1的表达强度与患者性别、年龄、肿瘤大体类型、组织类型和分化程度无关。结论:肺癌细胞中Tiam1蛋白的表达强度高于正常肺组织和胚胎肺组织,Tiam1的表达与肺癌的形成、进展及转移密切相关。     

miR-29c通过Tiam1抑制人食管鳞状细胞癌侵袭和转移的研究

目的研究微小RNA(mi R)-29c通过靶向T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)基因对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞侵袭和迁移的影响。方法通过细胞划痕和transwell实验观察mi R-29c过表达的ESCC细胞侵袭迁移能力的变化;通过免疫印迹法和sensor reporter实验研究mi R-29c对Tiam1的调控作用和靶标位点;在细胞"拯救"实验中通过免疫印迹法检测相关蛋白表达量的变化以及用免疫荧光-激光共聚焦显微镜观察细胞形态的改变,研究mi R-29c抑制ESCC细胞侵袭迁移的调节机制。结果细胞划痕实验和transwell实验显示mi R-29c能抑制ESCC细胞的侵袭迁移;通过生物信息学方法预测mi R-29c的靶基因是Tiam1;免疫印迹法和sensor reporter检测结果显示mi R-29c通过与Tiam1 3'-非翻译区(UTR)结合降解Tiam1;细胞功能"拯救"实验的细胞划痕、免疫印迹法和免疫荧光结果显示mi R-29c能抑制Tiam1的表达,导致激活态Rac1-三磷酸鸟苷(GTP)减少,致使细胞运动状态改变,迁移能力减弱;而人工合成的针对Tiam1的特异si RNA分子si Tiam1的干涉作用能"拯救"mi R-29C对ESCC细胞迁移能力的抑制。结论 mi R-29C通过降解Tiam1 m RNA,下调了Rac1的激活水平,导致细胞运动状态变化,从而抑制ESCC细胞的侵袭迁移。     

An episomally maintained MDR1 gene for gene therapy

Potential applications of the MDR1 multidrug transporter in gene therapy include protecting sensitive bone marrow cells against cytotoxic drugs during cancer chemotherapy and serving as a dominant selectable marker when coexpressed with a corrective passenger gene. To address safety concerns associated with integrating viral systems, such as retroviruses, we tested the feasibility of maintaining a nonvirally delivered MDR1 gene (pEpiHaMA) episomally. An MDR1 vector containing the Epstein-Barr virus (EBV) origin of replication (OriP) and its nuclear retention protein (EBNA-1) was transfected into human (KB-3-1) cells. MDR1 was expressed at a higher level in cells carrying the episomal vector, pEpiHaMA, compared with the vector lacking sequences needed for episomal maintenance (pHaMA). Furthermore, more drug-resistant KB-3-1 colonies were obtained on selection after transfection with pEpiHaMA. These observations correlated with longer maintenance of episomes in cells transfected with pEpiHaMA. In addition, episomes could still be recovered for more than 1 month from tumor explants in nude mice that were injected with pEpiHaMA-liposome complexes after drug selection, suggesting that these constructs can be maintained extrachromosomally in vivo.     

SASH1基因研究进展

SASH1（SAM-and SH3-domain containing 1）基因是进化保守的SLY基因家族的一员,广泛表达于人体多种正常组织（淋巴样干细胞除外）。其可通过调节细胞生长、增殖和凋亡等,参与多种疾病的发生发展。本文对SASH1基因的分子结构、功能、调节通路及与肿瘤等疾病的关系作一综述。