人羊膜来源间质干细胞的分离、培养及鉴定

目的:探讨来源于人羊膜间质干细胞(amniotic-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的分离、培养及鉴定.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,加入胰酶37℃消化30 min,共2次,然后加入终浓度1.0 g/L的胶原酶和0.1g/L的DNA酶,37℃消化60 min,收集细胞,用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基进行培养和纯化.倒置显微镜观察细胞形态,取4～6代的细胞用流式细胞仪分析细胞表面标志,取扩增第3代后的AD-MSCs加入全反式维甲酸(RTRA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)向神经元样细胞诱导分化.结果:来源于羊膜的细胞种植于DMEM/F12培养基中后,可在体外大量扩增并纯化;流式细胞检测显示:CD29、CD44、HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45、HLA-DR阴性表达.免疫细胞化学显示AD-MSCs经RTRA和bFGF诱导后表达神经元特异性烯醇化酶,不表达胶质纤维性蛋白.结论:羊膜中存在间质干细胞,其可以在体外培养、扩增、纯化,并可在体外向神经元样细胞分化.     

大鼠肾小球系膜细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探索一种重复性好、传代次数多的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)体外培养和鉴定的方法.方法:麻醉状态、无菌条件下取得大鼠的肾脏,用3种不同目数的不锈钢筛网提取肾小球,搜集到的肾小球分别加入2.5 g/L、0.5异/LⅣ型胶原酶及2 g/L Ⅱ型胶原酶各5 mL,分别在37 ℃水浴箱中振荡消化20 min、30 min、25min,然后接种肾小球,比较不同培养条件下肾小球系膜细胞的生长状况.结果:Ⅱ型、Ⅳ型胶原酶3种不同浓度作用不同的消化时间,细胞的生长速度及生长状况不同,Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的为最佳.结论:培养的细胞为肾小球系膜细胞,用Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的肾小球系膜细胞生长状态最佳.     

用荧光钙指示剂喹2测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法

我们采用荧光钙指示剂喹2,建立了测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法,简报如下。 导入喹2的血小板悬液(QPS)的制备:将富含血小板血浆与10 μmol/L 喹2/AM混匀,置22℃水浴20 min,加入1μmol/L PGE_1,室温下430×g 离心 15 min,弃上层液。用1ml含1 μmol/L PGE_1和10μmol/L EGTA的HEPES无钙台氏缓冲液(HTB)使血小板悬浮并移至10ml体积已用HTB(含10 μmol/L EGTA)50ml平衡过的2％琼脂糖胶柱上,用相同缓冲液洗脱。过柱后将血小板悬液调至1×10~8血小板/ml和Ca~(2+)浓度至1 mmol/L,置22℃备用。对照血小板悬液(CPS)的制备:用等体积     

雷公藤药物血清体外对肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL-6的影响

1 材料和方法雷公藤经水浸30 min后,水提3次,30 min/次,水煎浓缩后含生药6.1 g/L. SD大鼠6只(中国药科大学动物房),雌雄不限,体质量200～250 g. 分为雷公藤组和对照组,每日6 mL/kg灌胃,7 d,于最后1次灌胃后2 h内静脉取血,离心取血清,56℃灭活,过滤除菌. MTT(Sigma),溶于PBS,浓度5 g/L,过滤除菌,4℃避光保存.     

冷凝集对XS-4000i自动血细胞分析仪的影响及处理

目的 探讨冷凝集对XS-4000i自动血细胞分析仪检查结果的影响及处理方法.方法 同一冷凝集标本分别采用手握标本10 min,手握20 min,37℃水浴标本30 min,血浆置换和置换血浆加手握10 min,进行血常规检测,比较五种方法的效果差异.结果 手握10 min、手握20 min和置换血浆加手握10 min均获得满意的血常规检测结果,MCHC值由540 g/L降至361~376 g/L,血浆置换和37℃水浴标本30 min效果较差,MCHC降至426~455 g/L.结论 手握10 min、手握20 min和置换血浆加手握均可以用于冷凝集标本血常规检测的前处理.     

HPV51DNA的HaeⅡ、AluI酶切片段的核苷酸顺序分析

<正> 我们将HPV51DNA用HaeⅢ、A1u I同时消化,然后在agarose上电泳,将电泳片段回收,将其与MP-18噬菌体连接。然后转染XL1 blue菌。在含I PTG及X-gel的上层agarose中,连接有HPV51片段的MP-18出现白色噬菌斑,反之,出现蓝色噬菌斑。挑取单个白色噬菌斑种入3mL YT培养基中,同时加入已培养4h的新鲜XL1blue细菌10μL,37℃振荡培养过夜,离心。上清中含带有HPV 51片段的单链MP-18。取1mL上清,加入300μL20％PEG,30μL5mol/L NaCl,6μLO。5mol/LEDTA(pH8.0),5μLRNase(10mg/mL),混匀后,置冰浴30min,离心。沉淀溶于100μL TE(pH8.0),加3μL20％SDS,3μL蛋白酶K(5mg/mL),混匀,     

共聚焦显微镜监测小鼠腹腔巨噬细胞膜电位

1 材料和方法 处死小鼠,腹腔内注射 5 mL 冷 Hanks 液,轻揉腹部,抽吸细胞悬液约 4 mL。细胞洗两次后,加含 10％ 小牛血清的 RPMI 1640 培养基 10 mL,接种于 96 孔板中, 每孔 01 mL,37℃ 静置 60 min,使巨噬细胞贴壁。用无血清培养液冲洗培养孔三次,去除未贴壁细胞,剩下贴壁的巨噬细胞。加入 01 mL 5 μmol/L 的 DBAC4(3)（美国分子探针公司产品,用无水乙醇溶解,用无血清培养液稀释）,室温温育 10 min。将 96 孔板置于共聚焦显微镜（美国 Meridian 公司 Ultima 型）的载物台上,调整到最佳扫描参数后开始动态扫描。在扫…     

大量提取质粒的简便方法

0　引言　质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作 .我们介绍一种非常简便的大量提取质粒方法 ,此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定、转化、探针标记等 .菌种为转化了重组 p U C19质粒的 DH5α E.coli.重组 p UC19质粒为在 H inc II位点插入不同的 PCR产物连接而成 .1　方法　挑一个单菌落接种于 5 m L L B/ Amp(含氨苄青霉素0 .1g· L-1 )培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,转 1m L菌液于 10 0 m L L B/ Amp培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,将菌液倒入两个 5 0 m L离心管 ,10 0 0 0 g离心 2 min,弃去上清 ,沉淀中加入 4…     

热休克蛋白70在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达

1　材料和方法1.1　材料　人肝癌细胞 SMMC- 772 1由本室保存 ;鼠抗人HSP70单抗、FITC标记的羊抗鼠 Ig G购自 BOSTER公司 ;ENVISION HRP标记的羊抗鼠 Ig G(即用型 )为 DAKO公司产品 .1.2　方法　 1细胞的热休克处理 :接种 2× 10 4SMMC- 772 1于置有盖玻片的 2 4孔培养板中 ,37℃培养过夜 ;将培养板置42℃水浴 2 h,分别于休克后 4,8,12 ,16 ,2 4和 48h,收集细胞爬片 ,以甲醇∶丙酮 (V/ V=1/ 1) 4℃固定 15 min,PBS(p H7.4)洗涤后 ,室温干燥备用 .2免疫组化法检测 HSP70在肝癌细胞的表达 :采用 ENVISION(两步法 ) .细…     

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的 探讨影响大肠杆菌DH5 a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素.方法 于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5 a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞.在电压2.5kv、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率.结果 于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高速1.01×1010CFU/μg DNA.结论 该法适合于大肠杆菌DH5 a,可获得较高的转化效率.     

经标化和稳化的木瓜蛋白酶试剂的应用

1　材料和方法1.1　材料　木瓜蛋白酶抗痛素试剂盒由南宁市华南生物工程公司提供 ;抗人球蛋白血清、抗 D人血清、O型筛选细胞、普通菠萝酶试剂由上海市血液中心提供 ;Rh D阴、阳对照红细胞 ,标准 A细胞、B细胞、O细胞由本室制备 .1.2　方法　间接抗人球蛋白 (IAT)及菠萝酶二步法 ,参照《中国输血技术操作规程》[1 ] .木瓜蛋白酶抗痛素法 (P-a) :取 30 mg· L- 1红细胞悬液 1滴加入木瓜蛋白酶试液 1滴37℃水浴 5 min,酶化受检细胞 ;取酶化细胞 1滴 ,加入抗痛素1滴 ,再加入血清 1滴 ,37℃水浴 10 min;5 0 0 g离心 15 s后观察结果 .利用测…     

细菌培养前痰液处理的观察

采用lg/L胰酶溶液与玻璃碎片振荡相结合的方法对痰液进行前处理后再接种培养，使培养阳性率明显提高，报告如下。1材料与方法1.1标本来源系我院呼吸道感染病人，共收集l86份痰标本。1.2标本容器玻璃小瓶装入十几块约5mm大小玻璃碎片高压灭菌：1.3试剂 lg／L胰酶溶液：称lg胰酶(美国DIFCD公司)加入l L高压灭菌后pH 7.40.01mol／L PBS溶液中。1.4方法取无菌瓶内痰液，接种血、麦康凯、含X、V因子的巧克力平皿、苯乙醇培养基(培养基均购自天津金章医用技术研究所)进行培养，同时将剩余痰液倒入盛有玻璃碎片的无菌瓶内.加等量1g／L胰酶振荡消化5min.取混悬液接种上述四种培养基置孵箱(巧克力置烛缸35℃24h)培养。     

健康人和肿瘤患者血液化学发光初步观察(简报)

选健康献血者55例,其中男32例,女23例;良性肿瘤20例,恶性肿瘤36例(均为本院住院患者),入院后次日清晨取静脉血50μl,加入0.95ml、0.15M PBS(pH7.4),37℃水浴10min。加入0.1m鲁米诺(2×10~(-4)mol/L),移至发光仪暗室内,37℃放置10min。测定静息化学发光(CL)。加入酵母多糖(10mg/ml)测定刺激CL,记录峰值和峰时。CL以cpm/50μl全血表示。健康男性血静息CL1521.5±482.7(5min积分值,x±s),酵母多糖刺激CL的峰时20.1±3.5分,峰值2146.5±3767.6cpm。女性血CL分别为1641.2±576.4、19.7±4.4分和2501.9±1857.0cpm.两组无统计学差     

人参皂苷溶血测定的实验条件研究

目的:确定人参皂苷溶血测定中最优的实验条件.方法:用紫外分光光度法测定溶血度,分别对比了离心速度和时间、水浴时间、灭菌和非灭菌缓冲盐溶液及生理盐水溶液、不同酸碱度环境下的检测波长对实验结果的影响.结果:确定最优的实验条件为:用生理盐水做溶剂;溶血测定中溶液的水浴条件为37℃水浴2h;离心条存为转速3000r/min离心10min;在575nm处用紫外分光光度计测定其吸光度,并计算溶血度.结论:该方法稳定性和重现性均较好,适用于人参皂苷的溶血测定.     

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig cDNA在体外培养细胞中的表达

1　材料　　293细胞购自ATCC（美国），鼠抗人CTLA-4Ig单抗购自Pharmingen公司，5 ml亲合层析柱HiTrap Protein A为Pharmacia公司产品。 2　方法 2.1　细胞培养 　　293细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液；人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞、HeLa细胞均用含5%小牛血的DMEM培养液。培养条件均为37 ℃，5%CO2，饱和湿度细胞培养箱中培养。     

内毒素对人红细胞膜蛋白激酶C活性的影响(简报)

蛋白激酶C是细胞信息传递过程中的重要中间环节。本研究观察内毒素对正常成人新鲜红细胞膜蛋白激酶C活性的影响,以探讨内毒素的毒性作用是否通过蛋白激酶C介导。实验取压积红细胞,加入不同浓度的大肠杆菌内毒素,置37℃,温育45min后,悬于含2mmol/LEDTA、25mmol/L Tris/HCl、50mmol/L巯基乙醇的缓冲液(简称缓冲液B)中匀浆,离心(106000×g,4℃,60min)后取沉淀,加入含0.3％Triton X-100的缓冲液B,在4℃置60min,再离心(106000     

急性脑血管病患者血浆溶血磷脂酸含量的变化

1 临床资料符合全国脑血管病诊断标准,并经MRI或(和)CT扫描证实. 急性脑血管病患者94例分为: ①短暂脑缺血发作组29(男16,女13)例,平均年龄54.3(40～76)岁;②动脉硬化性脑梗死组44(男24,女20)例,平均年龄61.1(34～82)岁;③原发性脑出血组21(男10,女11)例,平均年龄55.4(42～67)岁. 对照组为健康老年20(男10,女10)例,平均年龄60.2岁,无心脑血管病史,体检亦未发现明显的心脑血管疾病. 诊断后立即采集静脉血3 mL置于抗凝管中. 血浆溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)分析试剂购自北京泰福仕科技开发公司. 按试剂说明书进行:将抗凝血按4000 g离心10 min,吸取上清1 mL;抽提磷脂成分并浓缩分离;最后加入显色剂,于90℃水浴箱中放置90 min;取出并置于室温35 min后测定. 结果患者血浆LPA含量升高(表1). 首次采血后24和48 h在自行缓解或抗凝治疗后血浆LPA水平分别为(1.34±0.89)和(1.07±1.01) μmol/L,均显著低于首次检测含量(P<0.01).     

免疫抑制剂对白细胞糖皮质激素受体的调节作用

1　材料和方法1.1　材料　取女性献血员静脉血 2 0 0 ml,肝素抗凝 ,弃血浆 ,加 2倍体积的 PBS、1.5倍体积的 Dextran T5 0 0混匀静置 15min,上清液 2 0 0 0 r/min离心 5 min,取沉渣加 Tris- NH4Cl溶液 37℃温育 10 m in,使残余的红细胞破裂 ,2 0 0 0 r/m in离心 5min,取沉淀物 ,用 PBS洗 2次 ,即可得到白细胞悬液。1.2　方法　 Dex、CTX、Cs A均设有 0 .0 1、0 .0 5、0 .1、0 .5、1.0、5 .0 mg/m l共 6种浓度 ,选择三药单用及三药合用 ,分别加入上述白细胞悬液中作用一定时间后进行白细胞 GR特异结合测定 ,采用放射配体结合法 ,3 H…     

小鼠子宫内膜的组织培养

目的:建立小鼠子宫内膜的体外培养方法.方法:用挤压法获得子宫内膜,在添加200 mL/L胎牛血清(FBS),17.5 nmol/L胰岛素,63.5 nmol/L孕酮(P4),7.14 nmol/L雌二醇(E2)的F12/DMEM(1:1)培养液和50 mL/L CO2 950mL/L空气界面进行培养,比较分析20μg/L表皮生长因子(EGF)和50 mL/L CO2 950 mL/L O2气体条件对子宫内膜维持的影响.HE染色,图像分析系统检测样本坏死率,并用SP法检测培养前后子宫内膜中白血病抑制因子(LIF)及类肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)的表达.结果:三组子宫内膜的坏死率(%)分别为19.40±3.38,16.41±3.40和13.71±2.89,其差异有显著性(P=0.000);LIF及HB-EGF在培养前后小鼠子宫内膜的阳性表达率均为100%,且同一指标在培养前后子宫内膜的阳性强弱分布无显著性差异(P分别为0.237,0.224).结论:添加200 mL/L FBS,63.5 nmol/LP4,7.14 nmol/L E2,17.5 nmol/L胰岛素和20μg/L EGF的F12/DMEM(1:1)培养液和50 mL/L CO2 950 mL/L O2的气体环境最有利于小鼠子宫内膜的体外培养;子宫内膜在上述条件下培养24 h后,对囊胚仍具有容受性.     

悬浮红细胞复温后输注的输血反应调查

目的:观察悬浮红细胞复温后输注的输血反应发生率.方法:追踪调查悬浮红细胞1 266袋,分为复温组;未复温组.复温组是将悬浮红细胞在37℃恒温水浴5 min,输注后观察输血反应发生率.结果:输血反应主要表现为发热及皮疹.输血反应发生率:复温组3.0%;未复温组6.6%,复温组输血反应发生率明显低于未复温组.结论:悬浮红细胞在37℃恒温水浴5 min,复温后输注可有效地降低输血反应发生率.