诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探索用骨形态发生蛋白(BMP)-2和高分子透明质酸在体外诱导骨髓基质细胞(MSC)向软骨细胞分化的可能性。方法自兔双侧股骨粗隆处抽取4～6ml骨髓后在体外行原代和传代培养,实验分为两组,实验组培养液中含BMP-2(100ng/ml),培养瓶底预涂高分子透明质酸;对照组常规培养及传代。传代细胞玻片行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、碱性磷酸酶染色(ALP)、免疫组织化学染色;培养细胞与聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)复合后植入自体兔股部肌内,大体及组织学观察形成的结节。结果实验组传代细胞,尤其是第3代细胞甲苯胺蓝染色阳性,免疫组织化学染色S-100蛋白阳性,兔股部植入PLGA-细胞后3周形成软骨结节;而对照组免疫组织化学染色个别细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原染色阳性,植入PLGA-细胞后主要形成纤维组织。结论应用BMP-2和高分子透明质酸有效诱导MSC向软骨细胞分化,MSC源性软骨细胞可作为软骨组织工程修复关节软骨损伤的较理想的种子细胞。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法＋贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养:与同腔软骨性状的对比简

背景：临床发现膝关节内游离体能长期存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性,因此大胆提出假设：关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境并提出“腔内培养,腔内移植”的理念。目的：观察兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质体外培养或关节腔内培养组织工程软骨与同腔软骨的性状差异。 方法：实验分3组进行,体外培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质体外复合培养;腔内培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质以筋膜包裹,复合培养于成年新西兰兔膝关节腔内,以同腔内正常软骨为对照。 结果与结论：培养12周后：①体外培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞少量增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,少量周围基质包绕;Masson染色阳性区域小,细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学见软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒。②腔内培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,软骨陷窝形成,周围基质包绕;Masson染色阳性,软骨细胞多,基质蓝染,按一定应力方向排列;Ⅱ型胶原免疫组织化学见细胞外基质中出现较多棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。说明骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨,关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。     

骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞体内移植修复软骨缺损

背景:以往主要采用磨削灌洗、钻孔、微骨折技术等对软骨缺损组织进行修复,但多数技术被认为具有一定的局限性,只能减轻患者疼痛或仅短期有效。近年来越来越多的研究表明,软骨组织工程修复技术对于软骨再生及修复具有重要意义。目的:观察自体骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞修复兔膝关节髁间窝软骨缺损的效果。方法:取新西兰大白兔28只,随机均分为两组,建立双侧膝关节髁间窝关节软骨缺损模型,实验组左侧植入自体骨膜与骨髓间充质干细胞-软骨细胞复合物,右侧不植入任何材料作为空白对照;对照组左侧植入自体骨膜,右侧不植入任何材料作为空白对照。术后第8,12周,取膝关节软骨缺损部位新生组织,行大体、组织学观察及Wakitani评分。结果与结论:术后12周,实验组修复组织表面基本光滑,与周围软骨色泽极其相近,出现大量软骨细胞及软骨陷窝,形成软骨基质,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,甲苯胺蓝染色较深;对照组修复组织仍为白色,新生修复组织局部凹陷,表面欠光滑,质地较硬,仅有极少量软骨细胞,甲苯胺蓝染色较浅,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,无软骨基质形成;空白对照组软骨缺损塌陷,表面不规则,修复组织为纤维组织,甲苯胺蓝染色较浅。表明自体骨膜复合骨髓间充质干细胞与软骨细胞移植能够较好修复关节软骨缺损。     

聚乙醇酸-乳酸共聚物复合Ⅱ型胶原和生长因子体内构建组织工程软骨

背景:软骨组织工程的发展为处理关节软骨损伤提供了新的思路和方法,使体内构建组织工程软骨得以实现.目的:观察骨髓基质干细胞种植到复合胶原和生长因子的聚乙醇酸-乳酸共聚物(poly-lactide-co-glycolic acid,PLGA)生物材料,再种植到大鼠体内构建组织工程软骨组织的可行性.方法:相分离法制作PLGA,复合Ⅱ型胶原和碱性成纤维细胞生长因子,转化生长因子β1.将第3代的骨髓基质干细胞种植到复合材料上.36只SD大鼠随机分为实验组、对照组、空白组,分别于肌袋内植入骨髓基质干细胞/复合生长因子和胶原的PLGA、复合生长因子和胶原的PLGA、复合胶原的PLGA,于术后第4,8,12周取材观察细胞的定向分化及生长情况,包括大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色、扫描电镜观察.结果与结论:大体观察可见实验组材料有类软骨样组织生长,而对照组和空白组则仅见纤维组织生长.各种染色及电镜观察显示:实验组复合物内可见多的成软骨细胞及少量的破骨细胞.实验组甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组和空白组均为阴性.从而证明胶原修饰的PLGA生物材料具有较好的细胞相容性;骨髓基质干细胞种植到复合胶原和生长因子的PLGA生物材料上在大鼠体内可构建组织工程软骨复合组织.     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

背景:以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况.目的:观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性.方法:将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料.术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05).说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法.     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损（英文）

背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组（P〈0.05）。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的：探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。 方法：实验于2005—09／2006—02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊，雌雄不拘，体质量20—30kg。①采用Percoll分离液，经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞，体外培养至第3代时，将骨髓间充质干细胞分为2组，实验组细胞贴壁后更换培养液，以无血清H—DMEM特定培养液诱导（内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10^-7mol／L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生索C50mg／L），对照组加含10％胎牛血清的L—DMEM培养液，3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构，分别在诱导后的第7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。 结果：①相差显微镜观察实验组诱导14d后，细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变。并出现聚集成堆现象，而对照组细胞仍保持均一的梭形，增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多，胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体，表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑，胞核呈条状，核壁有许多皱裴和突起，细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。 结论：骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型．可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

三维支架中骨髓间充质干细咆及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景:软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现.目的:考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性.方法:抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增.取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原,透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养.2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况.结果与结论:种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱.结果提示,在同样条件下骨髓问充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例（10%,20%,50%,80%,100%）的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的:组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路,但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求.探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性,并评价修复效果.方法:实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成.①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞,观察细胞的增殖和基质合成,绘制细胞生长曲线.②将细胞终浓度为3x 108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨摹质的24孔培养板中进行接种培养2,4,6 d,计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率.③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型,随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组,每组18只.实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞;脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质;空白对照组不作任何植入.移植术后6,12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测.结果:54只青紫兰兔均进入结果分析.①共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖加快.脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(46.50±1.40)%,(93.25±2.89)%和(88.34±0.76)%.②大体观察结果:实验组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固.脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复.③组织学评分:实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组,差异具有显著性意义(P＜0.01),脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好.结论:自体骨髓问充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞,骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,可节省大量的软骨细胞,与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损.     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养:两者培养比例筛选

背景:骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨.目的:拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数.方法:软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组:单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7:3,5:5,3:7组;以及单纯骨髓基质细胞组.传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:共培养各组在各个时期细胞表型正常.G1～G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降.共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高.综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5:5,3:7组为最佳.软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5:5或3:7的比例为最佳.     

兔股骨头骨形态发生蛋白—2的分布和意义

目的 观察兔股骨头骨形态发生蛋白－2（BMP－2）的分布规律。方法 成年日本大耳白兔，取股骨头标本行免疫组织化学染色，光镜下观察染色情况。结果 关节软骨放射带和骺板成熟带软骨细胞以及成骨细胞和胞浆中染色强阳性，骨基质中沿胶原纤维有阳性染色；软骨钙化带和骺板钙化带部分软骨细胞染色弱阳性；软骨和骺板其余各区软骨细胞和骨细胞胞浆中染色阴性，软骨基质染色阴性。结论 关节软骨放射带和骺板成熟带软骨细胞能合成BMP－2，随软骨细胞的变性，这一能力降低以至消失，BMP－2对骨组织的代谢有重要作用。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

胎儿骨髓间质干细胞的获得和诱导成软骨培养

研究 胎儿骨髓间质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增并向软骨细胞表型转化，探究新的组织工程化软骨种子细胞的来源，方法：从引产胎儿(家属自愿捐献)髂骨获得骨髓，体外培养从骨髓中获得的MSCs，以流式细胞仪检测细胞表面抗原。将传代后的MSCs在诱导培养液中培养，检测软骨细胞的特异性标志物。结果：从胎儿骨髓得到的细胞表达MSCs的表面标志物，并可在体外培养、扩增，诱导后细胞变为多伪足的多边形细胞，扫描电镜见细胞表面有丰富的交联，透射电镜观察见大量粗面内质网、高尔基体、线粒体。甲苯胺蓝染色见细胞内有异染性基质(免疫组化和RT-PCR检测COLⅡ表达阳性。结论：胎儿MSCs可作为软骨组织工程的较理想的种子细胞。     

新西兰兔关节软骨细胞分离培养与鉴定的实验研究

目的 探讨新西兰兔关节软骨细胞体外分离、培养及鉴定的实验方法.方法 单纯采用Ⅱ型胶原酶消化新西兰兔关节软骨组织以分离软骨细胞,经体外培养后,以形态学观察、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白细胞化学染色对软骨细胞进行鉴定.结果 倒置相差显微镜显示3代以内软骨细胞呈多角形或三角形,核为圆形或椭圆形;甲苯胺蓝染色可见细胞呈紫蓝色,细胞基质呈蓝色;Ⅱ型胶原蛋白细胞化学染色可见胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒,细胞基质内也有少量棕黄色颗粒.结论 成功建立了新西兰兔关节软骨细胞分离及培养体系,3代以内软骨细胞生长良好,保持稳定的生物学特征,传代4次后出现"去分化"现象.     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景:用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论.鉴于此,课题组提出"同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨"的实验设技.目的:同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法.方法:分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组:实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子.比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况.制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养.分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析.结果与结论:实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01).实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞.组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性.提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨.同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求.