EGCG干预LMPl激活的AP-1信号转导通路

目的 探讨EGCG对鼻咽癌细胞激活蛋白1(AP-1)信号转导通路的干预作用，阐明在鼻咽癌细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl)活化的AP-1信号转导通路中靶分子的机制。方法 采用EB病毒阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1-LMP1细胞。利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察EGCG对CNE1和CNE1-LMP1细胞的生存率的影响。采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对AP-1活性的作用。利用间接免疫荧光法观察EGCG对JNK核移位的影响，再分别提取CNE1和CNE1-LMP1的胞浆及胞核蛋白，Western blot分析EGCG抑制JNK的核移位后，胞浆及胞核蛋白中JNK的变化。采用Western blot分析EGCG对c-Jun的磷酸化水平的影响。采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对cyclinD1启动子活性的影响，并用Western blot分析EGCG对cyclinD1蛋白表达的作用。结果 EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性，并可抑制AP-1的活性。EGCG能抑制JNK的核移位，并抑制c-Jun的磷酸化。EGCG对AP-1信号通路下游的靶基因cyclinD1的启动子活性及其蛋白表达都有抑制作用。结论 EGCG对信号转导通路上的AP-1、JNK、c-Jtm、cyclinD1多个靶点分子具有干预作用。LMP1是EB病毒这种编码的蛋白，因此，EGCG抑制与病毒相联系的信号转导通路，可能是EGCG抑制与病毒相关的肿瘤的分子机制之一。     

鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LMP1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长特性的影响

目的研究鼻咽癌细胞系ＳＵＮＥ中ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１）基因对上皮细胞生长特性的影响，探索ＬＭＰ１在鼻咽癌发生中所起的作用。方法用ＬＭＰ１基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞，检测ＬＭＰ１的表达，观察细胞的生长状态、生长速度、在软琼脂中的集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果被ＬＭＰ１基因转染的细胞生长旺盛，丧失接触抑制，生长速度增快，在软琼脂中能够形成多个集落，并能在裸鼠体内成瘤。结论ＬＭＰ１基因能明显改变上皮细胞的生物学行为，促进细胞的生长、增殖和转化，使转染的上皮细胞获得肿瘤细胞的生长特征。     

靶向LMP1基因siRNA作用对AP-1及其相关因子表达的影响

背景与目的: 潜伏膜蛋白LMP1是EBV基因组BamH I Nhet片段上BNLF1编码的一种跨膜蛋白,它是发现最早的能在体外恶性转化细胞系的EBV潜伏期蛋白.本研究旨在探讨LMP1沉默对AP-1信号转导通路及其下游与细胞转化、增殖和凋亡等相关冈子转录表达的影响.方法: 应用50 nmol/L靶向LMP1功能区编码序列的siRNA649转染EBV阳性的胃癌上皮细胞GT38,分别作用24、48、72、96、120 h,采用RT-PCR检测c-Jun,生存素,CDK4和MMP9 mRNA转录水平:免疫组化法检测细胞生存素蛋白表达;Western印迹法检测c-Jun,JunB和CDK4蛋白表达.结果: 靶向LMP1特异性siRNA作用后,各时间点c-Jun和生存素mRNA水平均明显低于细胞对照组(P＜0.05),c-Jun以24 h时降低最为明显,而生存素以48 h时降低最为明显;CDK4 mRNA水平均明显高于细胞对照组(P＜0.05);转染后24、48、72 h时MMP9 mRNA表达水平均明显低于细胞对照组(P＜0.05),96 h和120 h时MMP9则无明显改变(p＞0.05).与细胞对照比较,c-Jun和JunB蛋白表达均下调,JunB蛋白表达往作用第5天时有所恢复,CDK4蛋白表达均上调.免疫组化检测结果显示转染后细胞质中代表生存素阳性的棕色颗粒明显减少.结论: 靶向LMP1功能区编码序列的siRNA转染可影响EBV阳性胃上皮细胞AP-1及其下游相关因子的表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.     

两种不同来源 LMP1致瘤性的比较研究

目的：比较鼻咽癌来源的LMP1基因（N-LMP1）和标准株B95.8来源的LMP1基因（B-LMP1）的致瘤性。方法：将带有N-LMP1及B-LMP1的两种真核表达载体分别转染小鼠成纤维细胞系NIH3T3，获得稳定表达LMP1的细胞，通过软琼脂集落形成试验及裸鼠致瘤试验比较两种细胞的致瘤性。结果：获得稳定表达N-LMP1和B-LMP1的两种NIH3T3细胞；NIH3T3/N-LMP1的集落形成率和成瘤率均明显高于NIH3T3/B-LMP1。结论：N-LMP1的致瘤性强于B-LMP1，进一步确证了中国鼻咽癌来源的EBVLMP1比一般的EBV LMP1具有更强的致瘤性，也为在中国鼻咽癌流行区可能存在一株特殊的EBV株系提供了一定的依据。     

AP-1信号转导通路与肿瘤转移的研究进展

转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一.近年来,激活蛋白1(AP1)信号转导通路与肿瘤的研究取得了很多突破性进展,许多瘤基因能通过活化AP-1促使细胞的转化和癌变,同时,AP-1的活化也能促使下游靶基因如MMP、整合素、CD44和VEGF等基因的异常表达,参与细胞基质降解、异常粘附、转移瘤新生血管生成等多个侵袭转移环节,提示AP-1信号转导通路的活化与肿瘤的侵袭、转移密切相关.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导鼻咽癌细胞中转录因子Ets-1表达的实验研究

目的 探讨鼻咽癌(NPC)细胞中EB病毒潜伏膜蛋白1(EMP1)是否可介导转录因子Ets-1的表达。方法 采用受四环素(Dox)调控的、LMP1表达的NPC细胞系(pTet-on-LMP1 HNE2),用Dox诱导LMP1表达,并检测Ets-1的表达。采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测Ets-1 RNA水平的变化;应用Western blot方法检测Ets-1蛋白质表达情况;应用免疫共沉淀和Western blot方法检测Ets-1磷酸化水平;应用EMSA方法检测Ets-1的DNA结合活性。结果 在不同诱导时间、不同浓度Dox诱导的pTet-on-LMP1 HNE2细胞中,LMPl表达与Ets-1 RNA表达、蛋白质表达、苏氨酸磷酸化水平及DNA结合活性在一定范围内呈正相关。结论 IMP1可介导NPC细胞中Ets-1的转录活化和表达,可能是LMP1致瘤的新机制。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1、VEGF和cyclinD1在乳腺癌中的表达及其相关性

目的:探讨乳腺癌中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMPl)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达及其相关性.方法:收集乳腺癌标本构建组织芯片,应用免疫组化方法检测LMP1、VEGF和cyclinD1的表达,并结合临床病理因素进行相关分析.结果:乳腺癌组织中LMP1、VEGF及cyclinD1的表达率分别为17.8％(19/107)、85.0％ (91/107)和64.5％ (69/107);LMP1和cyclinD1的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型、淋巴结转移及脉管侵犯均无明显相关性(P＞0.05),而两者的表达均与组织学分级有关(P＜0.05);VEGF的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型、组织学类型及脉管侵犯均无明显相关(P＞0.05),而与淋巴结转移存在相关性(P＜0.05);LMP1的表达与VEGF和cyclinD1均明显相关(P＜0.05),同时,VEGF与cyclinD1表达明显相关(P＜0.05).结论:乳腺癌中LMP1可能直接上调VEGF的表达,或者LMP1通过促进cyclinD1的表达来上调VEGF的表达,从而对乳腺癌的淋巴转移及发生发展起到促进作用.     

EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的研究进展

EB病毒与鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、霍奇金病和某些因机体免疫力下降而产生的淋巴增生性疾病密切相关,其中EB病毒与鼻咽癌的关系尤为受到重视.EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)在细胞的恶性转化中起着相当重要的作用,又与鼻咽癌病人的治疗和预后有着密切的关系,本文就EB病毒潜伏膜蛋白1的研究近况与鼻咽癌治疗与预后判断进行综述.     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进MMP9表达

目的 探讨EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV)LMP1是否通过NF－κB和AP－1促进MMP9表达,为全面阐明LMP1的分子致瘤机制提供实验依据。方法 将MMP9－CAT表达质粒导入HNE2－pSG5、HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2－LMP1 Δ187-351鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC) 细胞系,比较各组细胞系的氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否上调MMP9转录;采用明胶Zymography法检测上述细胞产生MMP9的活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否促进MMP9蛋白表达;借助报道基因分析法确定在NPC中野生型LMP1能否激活NF－κB和AP－1的活性,进一步将突变了NF－κB或AP－1结合位点的MMP9－CAT表达质粒导入上述细胞系;比较相应的CAT活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否通过NF－κB或AP－1上调MMP9表达。结果 与导入载体pCDNA3比较,HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351 NPC细胞系CAT活性分别提高7.2,1.3,3.3和4．0倍。明胶Zymography法检测显示,在HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系中,均可检测到92000 MMP9活性,而HNE2－pSG5、HNE2－LMP1（1－231）几乎均为阴性。较之母细胞,野生型LMP1活化NF－κB及AP－1分别为13．8和8．4倍。导入NF－κB mut MMP9的HNE2－LMP1、HNE2－（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系CAT活性,与导入MMP9－CAT相应的细胞系比较,分别下降至原有水平的18．1％、35．0％和29．1％;而导入AP－1 mut MMP9,则分别下降至原有水平的16．3％、33．3％5和26．1％,HNE2－pSG5、HNE2（1－185）影响不大。结论 LMP1 CTAR1与CTAR2可能通过NF－κB或AP－1促进MMP9表达,从而有助于NPC侵袭与转移。     

Effects of eb virus encoded LMP1 on differentiation of nasopharyngeal carcinoma cells

Latent membrane protein 1 (LMP1) is encoded by the BNLF1 fragment of Epstein-Barr virus (EBV) and recognized as an important oncoprotein nowadays. It is popularly known that EBV infection is closely associated with the development of nasopharyngeal carcinoma (NPC), and LMP1 would play its crucial role in nasopharyngeal carcino- genesis. LMP1 has a variety of carcinogenic functions. LMP1 can immortalize and malignantly transform normal lymphocytes or epithelial cells with the cooperat…     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响

背景与目的:已证实EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein,LMP1)具有转化致瘤作用,在鼻咽癌的发生发展中起重要作用。LMP1的转化致瘤作用可能与细胞凋亡有关,本实验目的是观察EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响,探索LMP1在鼻咽癌发生发展中的可能机制。方法:用电转染的方法将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,用荧光显微镜检测报道基因GFP的表达情况;用免疫组化法及Westernblot法检测目的基因LMP1的表达情况;用流式细胞仪、荧光染色及DNA片段分析等方法检测在有地塞米松磷酸钠或无血清饥饿诱导的情况下LMP1对CNE1细胞凋亡的影响。结果:CNE1G细胞(转染空载质粒PAT-GFP的CNE1细胞)及CNE1GL(转染目的基因质粒PAT-GFP-LMP1的CNE1细胞)有绿色荧光蛋白表达,CNE1细胞(未经转染的CNE1细胞)无绿色荧光蛋白表达;CNE1GL细胞LMP1呈阳性表达,而CNE1及CNE1G细胞均为阴性。CNE1、CNE1G及CNE1GL3组细胞分别用地塞米松磷酸钠或无血清1640培养液处理后均有凋亡出现,且两种诱导方法均能使CNE1GL组细胞的凋亡指数(apoptosisindex,AI)较CNE1及CNE1G组明显增高(P<0.05),而CNE1与CNE1G组的凋亡指数无明显差别。3组细胞常规培养下则无凋亡出现。结论:LMP1基因成功导入CNE1细胞     

Epigallocatechin-3-gallate induces apoptosis and cell cycle arrest in HTLV-1-positive and -negative leukemia cells

The objective of this study is to evaluate the efficacy of epigallocatechin gallate against ATL cells. The anti-proliferative and pro-apoptotic effects of EGCG were evaluated in HTLV-1-positive and -negative cells. EGCG exhibited a marked decrease in proliferation of ATL cells at 96 h of treatment. The results indicated that TGF-α was down-regulated whereas levels of TGF-β2 increased. Cell cycle distribution analysis revealed an increase in cells in the pre-G₁ phase which was confirmed by ELISA. The results on proteins showed an up-regulation of p53, Bax and p21 protein levels while the levels of Bcl-2α were down-regulated.     

EFFECT OF TEA POLYPHENOLS AND EGCG ON NASOPHARYN- GEAL CARCINOMA CELL PROLIFERATION AND THE MECHANISMS INVOLVED

Tea (Camellia Sinensis) is a promising agent for the chemoprevention of human cancers[1,2]. The inhibitory activity of tea against tumorigenesis has been demonstrated in many animal models and has been suggested by some epidemiological studies[1-3], including those involving cancers of the lung, skin, esophagus and stomach[1,4,5]. Such activity has generally been attributed to tea catechins. Tea consists of several components, but interest has been focused primarily on polyphenols, especiall…     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端Xho I酶切位点的丢失

背景与目的：众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAamp DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho I对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果：10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho I酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79．37％)出现Xho I酶切位点的丢失(Xho I—loss),还有4例(6．34％,)为Xho I酶切位点部分丢失,只有9例(14．29％)未见Xho I酶切位点的丢失(wt-Xho I)。除了Xho I酶切位点的丢失(nt：169423～169428;GAGCTC→GA□TCTC)外,还发现四个错义点突变。结论：本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的：EB病毒LMP1基因为wt—Xho I,而在鼻咽癌组织中主要为Xho I-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。     

EVALUATION OF COMBINED EBNA1—IgA AND EA—IgG ASSAYS IN SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA

To evaluate the value of combined assays of serum EBNA1-IgA and EA-IgG for serological diagnosis of nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods:The serum EBNA1-IgA and EA-IgG were tested by use of ELISA for 56 patients with NPC and 58 healthy adults.The sensitivity,specificity,positive predictive value,accuracy rate and odds ratio of the 2 tests used singly or in combination were compared with each other.Results:The sensitivity of EBNA1-IgA test(91.09%)was higher than that (87.50%)of EA-IgG test.The specificity of EA-IgG test(87.93%)was higher than that (84.48%) of EBNA1-IgA test.The combined usage of EBNA1-IgA and EA-IgG could enhance the specificity(94.83%),predictive value of a positive test(0.9375),likelihood ratio of a positive test(15.5435) and odds ratio(75.0)for serological diagnosis of NPC.Forty-five NPC patients showed positivity to EBNA1-IgA and EA-IgG concurrently.A positive EA-IgG reaction was demonstrated in 4 out of 5 NPC patients with negative EBNA1-IgA reaction in 6 out of 7 NPC patients with negative EA-IgG result as well.Conclusion:Though high sensitivity and specificity could be obtained by EBNA1-IgA and EA-IgG test,respectively,the combined use of these 2 tests is able to enhancing the reliability of serological diagnosis of NPC.The majority of NPC patients showed positivity to ENBA1-IgA and EA-IgG concurrently.There is a complementary effect through using EBNA1-IgA and EA-IgG for serological diagnosis of NPC.     

V-val突变型EB病毒核抗原1的功能研究

背景与目的:EB病毒核抗原1(Epstein-Barr viral nuclear antigen 1,EBNA 1)对于维持EB病毒的潜伏感染有重要作用。V-val变异型的EBNA1与鼻咽癌有密切的相关性。本研究旨在比较原型和V-val变异型的EBNA1基因在上皮细胞中的功能的差异。方法:用PCR方法扩增出原型和V-val变异型EBNA1基因的全长并克隆到pGFP载体上,转染HEK293细胞,检测两种亚型的EBNA1蛋白的表达对细胞生物学性状的影响。以含有EB病毒增强子FR序列的荧光素酶载体作为报告基因,比较两种亚型的EBNA1基因对质粒的转录激活能力。结果:原型和V-val变异型EBNA1基因的表达对HEK293细胞的生长速度没有明显影响,但表达原型EBNA1的细胞的克隆形成能力明显低于V-val亚型。在裸鼠致瘤实验中,接种表达原型和V-val变异型EBNA1细胞的实验组均未见肿瘤形成。但是在瞬时转染实验中,表达V-val变异型EBNA1基因的HEK293细胞的荧光素酶活性明显高于原型EBNA1基因。结论:原型和变异型EBNA1均未发现有明显的转化细胞的能力,但是V-val变异型EBNA1蛋白与原型相比,其转录激活的功能明显增强。