成骨生长肽对骨髓基质细胞增殖和向成骨方向分化的影响

背景:成骨生长肽是新近发现的一种具有促进成骨作用的生长因子,其对骨髓基质细胞增殖分化作用受到越来越多的关注.目的:验证成骨生长肽在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.设计、时间及地点:随机对照实验,于2006-02/06在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成.材料:6周龄雄性SD大鼠用于骨髓基质细胞提取:成骨生长肽为Sigma公司产品.方法:体外培养骨髓基质细胞,加入含不同浓度(10-11,10-10,10-910-8,10-7mol/L)成骨生长肽及小牛血清的α-MEM培养基培养,以单纯含小牛血清的α-MEM培养基培养作对照.主要观察指标:①骨髓基质细胞的鉴定.②用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖情况.③酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶的表达.④反转录-聚合酶链反应法检测细胞内核心结合因子1mRNA的表达.结果:成骨生长肽对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P<0.05),最大效应浓度为10-9mol/L;能增加细胞内碱性磷酸酶活性(P<0.05),最大效应浓度为10-8mol/L:可诱导核心结合因子1mRNA的表达(P<0.05).结论:成骨生长肽可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内核心结合因子1mRNA的表达促进其成骨向的分化.     

PNH患者骨髓红系祖细胞体外培养的研究

采用造血祖细胞体外培养技术研究了阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）患者骨髓红系祖细胞（ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ）的增殖能力；骨髓细胞经新鲜酸化ＡＢ型血清处理后培养的ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ的增殖能力；以及ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ对红细胞生成素（Ｅｐｏ）的反应能力。发现ＰＮＨ患者骨髓ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ集落数明显低于正常；骨髓细胞经新鲜酸化ＡＢ型血清处理后培养的ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ集落数明显低于经热灭活酸化ＡＢ型血清处理后培养的集落数；ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ对Ｅｐｏ的反应回归直线呈低平状态。认为ＰＮＨ患者骨髓红系祖细胞膜缺陷可导致其在酸性条件下对补体的敏感性增高和导致其对Ｅｐｏ的敏感性降低。     

烧伤大鼠血清对骨髓红系粒系造血的影响

目的：观察烧伤血清对骨髓红系粒系造血的影响，探讨促进造血细胞增殖的物质。方法：用5kg溴钨灯致大鼠背部30％体表面积Ⅲ度烧伤，伤后无菌抽取大鼠血清。按10mg／L蛋白加入到骨髓红系或粒系体系中培养。结果：烧伤后3，12，24，48，72和96h，骨髓红系(CFU-E，RFU-E)和粒分(CFU-GM)集落数均显著高于正常对照组：伤后24h达3377，179．7，2405个／1&;#215;10^5骨髓有核细胞(bone marrow cell,BMC)；对照组仅98．5，68．7，1052个／1&;#215;10^5BMC；差异非常显著(t=8．3l，9．65，7．84，P&;lt;0．01)结论：烧伤血清对骨髓红系、粒系造血均有明显的促进作用。     

人脐血前红系祖细胞(BFU-E)体外培养的动态观察

<正> 脐血含各系造血干/祖细胞和多种造血集落刺激因子,是继骨髓、外周血、胎肝之后第4个新开发的、可移植的造血干细胞来源;还可静脉输注,用于一切放化疗后血细胞减少的病人、刺激造血功能,从而扩大了血源供应。笔者通过对37份人脐血和11份正常骨髓的BFU-E体外培养观察,再次证明脐血含有丰富的造血干细胞,并对脐血红系定向祖细胞的2个亚群(CFU-E、BFU-E)进行了动态观察,结果报告如下。     

血管紧张素Ⅱ对脐血红系造血祖细胞优势扩增作用的研究

近年来，许多研究结果表明血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可能参与调控造血细胞的生长，如红系造血干／祖细胞表面有血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的表达。然而，上述研究未阐明AT1R在粒系祖细胞上有无表达及AngⅡ对红系造血作用的分子机制。我们试图通过体外细胞培养的方法，探讨AngⅡ对红系造血祖细胞的优势扩增作用及其分子机制。     

合成成骨生长肽对人骨髓间充质干细胞成骨转化的促进

背景:成骨生长肽在体内外细胞培养中具有明显的促成骨活性,这种促成骨作用的分子机制还不清楚,现已通过人工方法成功制备了合成成骨生长肽.目的:探讨合成成骨生长肽对体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用.设计、时间及地点:基因和蛋白水平的细胞学体外观察,于2006-07/2007-12在福建省医学科学研究所基因工程实验室及复旦大学附属中山医院中心实验室完成.材料:骨髓标本来源于福建省立医院骨一科收治的男性髂骨植骨患者,合成成骨生长肽由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所崔大敖教授惠赠,ERK1/2抑制剂UO126为美国CST公司产品.方法:密度梯度离心法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,单纯矿化液组加入由10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸组成的矿化液;10-7,10-9,1011 mol/L合成成骨生长肽组分别加入对应浓度的合成成骨生长肽,再加入矿化液;常规培养组加入含体积分数为0.1胎生血清的低糖DMEM.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR法和免疫组织化学染色检测成骨标志物的表达,Westem-blot法分析合成成骨生长肽对ERK1/2信号通路的影响,观察UO126对合成成骨生长肽作用的干预.结果:加入合成成骨生长肽后,骨髓间充质干细胞体积增大,突起增多,呈多角形,胞浆含有较多颗粒状物质,出现致密细胞结节.合成成骨生长肽在mRNA和蛋白水平均能促进成骨标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原,骨钙素的表达,定量分析结果显示10-9mol/L合成成骨生长肽促成骨作用最强.加入合成成骨生长肽后能够引起ERK1/2信号通路的持续性激活,经UO126预处理后几乎完全阻断了合成成骨生长肽对骨髓间充质干细胞的促成骨作用.结论:合成成骨生长肽可明显促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向的转化,在10-9 mol/L浓度下促成骨能力最强,其促成骨作用可能是通过激活MAPK家族ERK1/2途径实现的.     

成骨生长肽缓释微球促成骨细胞的增殖

背景:采用生物可降解聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactide-co-glycolide,PLGA)为支架材料,包裹多肽、蛋白质药物制成缓释微球,使在体内达到缓释目的,是近10多年来各国学者大力研究的新领域。目的:观察成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)缓释微球对成骨细胞的促分裂增殖作用。设计、时间及地点:对比观察,于2006-06/11在西安交通大学生命科学院完成。材料:新西兰兔,用于制备成骨细胞;PLGA由山东医疗器械研究所提供。方法:以PLGA为载体材料,采用复乳法制备OGP-PLGA缓释微球,并对微球的形态学、粒径分布、载药量和包裹率及体外释药情况进行观察。实验分为2组,OGP组:培养液为含体积分数0.1小牛血清 含50μg/LOGP的DMEM;OGP缓释微球组:培养液为含体积分数0.1小牛血清 含50μg/LOGP-PLGA缓释微球的DMEM,分别测定成骨细胞的增殖数量。主要观察指标:①微球的形态、粒径分布、载药量、包裹率及体外释药性。②OGP缓释微球对成骨细胞增殖的影响。结果:①复乳法制备的OGP-PLGA缓释微球表面光滑圆整,球体均匀度好;微球粒径为(19.6±4.47)μm,载药量和包裹率分别为(83.9±4.21)%,(72.9±5.13)%;微球的体外释药过程较为稳定,56d释药率为85.43%。②培养1,2d时,OGP组的A值高于OGP缓释微球组,差异有显著性意义(P<0.05);培养3,4d时,OGP组和OGP缓释微球组间A值差异无显著性(P>0.05);培养6,8d时,OGP缓释微球组的A值高于OGP组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:采用复乳法制备OGP-PLGA缓释微球的工艺可行,微球中OGP的生物活性保存良好,能缓慢持续释放活性OGP,促进成骨细胞的体外分裂增殖。     

人类巨核系造血祖细胞培养的应用

自从1979年Vainchenker首次成功地培养出人类巨核系造血祖细胞(CFU-MK)以来,其培养方法日趋完善,已成为研究巨核系造血机制及巨核细胞相关疾病的有力工具,且已取得可喜进展。     

OGP对NIH3T3细胞作用机理的研究

目的：研究成骨生长肽(OGP)对NIH3T3细胞的作用机理。方法：细胞计数法测定不同浓度的OGP14肽及5肽对NIH3T3细胞的促增殖作用，以流式细胞仪测定细胞膜上OGP的表达。观察0GP抗体对OGP促增殖作用的影响。结果：OGP14肽及5肽在10^-11mol／L时对NIH3T3细胞有促增殖作用，同时细胞膜上OGP表达增加；OGP抗体可抑制OGP的促增殖作用，同时使细胞膜上OGP表达下降。结论：OGP14肽及5肽可以通过对OGP的正反馈来调节NIH3T3细胞的增殖。     

Low-Intensity Pulsed Ultrasound Promotes Osteogenic Differentiation of Reamer-Irrigator-Aspirator Graft-Derived Cells in Vitro

Recently, reamer–irrigator–aspirator (RIA) systems have been increasingly used to harvest autologous bone grafts. RIA graft materials contain bone marrow, which provides a viable source to derive large numbers of mesenchymal stem cells. Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) significantly accelerates the differentiation of stem cells derived from bone marrow. This in vitro study investigated the effect of LIPUS on the osteogenic activity and differentiation of RIA graft-derived cells. A small amount of RIA graft was obtained from seven patients. After the cells derived from RIA grafts were cultured, they were divided into two groups: the LIPUS and control groups. LIPUS was applied once daily for 20 min (1.5 MHz, pulse duration: 200 µs, pulse repetition rate: 1 kHz, spatial average-temporal average intensity: 30 mW/cm²). Alkaline phosphatase activity (113.4% and 130.1% on days 7 and 14), expression of osteoblast-related genes (ALP, Runx2) and mineralization (135.2% on day 21) of the RIA graft-derived cells were significantly higher in the LIPUS group than in the control group. However, LIPUS did not affect the cell proliferation of RIA graft-derived cells. This study indicates that LIPUS may enhance the healing of non-union and critical bone defects treated by autologous bone grafting using the RIA system.     

重组人红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖

为了观察重组人红细胞生成素（rhEPO）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖活性的影响，抽取健康志愿者的骨髓液，贴壁培养获取第3代细胞，通过细胞形态特征、细胞表面抗原及诱导分化的方法进行MSCs鉴定；取经过鉴定的第3代MSC（P3-MSC）加入不同浓度rhEPO（0．5、1、5、10、50U／ml）后培养，应用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖，用流式细胞术（FCM）分析细胞周期。结果发现：骨髓贴壁培养获取的第3代细胞同时表达CD105和CD90，不表达CD34和CD45，并可被诱导分化为脂肪、骨及软骨细胞，被鉴定为MSC。MTT结果显示EPO处理组的光密度值（OD）均高于对照组（P〈0．05）；50U／ml浓度EPO组作用最显著，细胞计数法获得的结果与其一致。FCM细胞周期分析表明，rhEPO能明显降低G0／G1期细胞比例，并提高S＋G2／M期细胞比例，与对照组相比，差异均具有显著统计学意义（P〈0．01）。结论：EPO能促进体外培养的人骨髓MSCs增殖，该效应与EPO调节其进入细胞增殖周期有关。     

bFGF和地塞米松对骨髓基质干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨碱性成纤维生长因子（bFGF）和地塞米松（Dex）在体外培养条件下对SD大鼠骨髓基质干细胞（MSC）增殖与分化的影响。方法：用DMEM冲洗股骨、胫骨骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶内进行体外培养及扩增，并分别加入不同浓度bFGF和Dex，通过MTT法检测2者对MSC增殖的影响，通过RT-PCR技术测定碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）的表达，了解2者对MSC分化的影响。结果：bFGF对MSC增殖呈剂量依赖性，10ng／ml时促增殖最明显；Dex对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用，并随Dex浓度的升高而增强。bFGF降低MSC的ALP活性及OCN、OPN的表达；而Dex以及2者联合应用则增加ALP活性，促进MSC的ALP、OCN及OPN表达增加。结论：bFGF促进MSC增殖、抑制其分化；Dex抑制MSC增殖，但可促进其分化，bFGF（10ng／m1）和Dex（10^-8mol／L）联合应用能有效的促进MSC的增殖和成骨分化。     

成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞增殖及分化作用的实验研究

目的：探讨成纤维细胞生长因子（bFGF）对骨髓基质细胞（NASP）的增殖及分化作用。方法：分离骨髓基细胞体外培养，化学染色行图象分析测定细胞克隆数；采用免疫组化（ABC法）检测PCNA，Ⅰ型胶原，研究bFGF与NASP的促增殖及分化作用。结果：骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁细胞形式存在，bFGF不仅能促进NASP细胞增殖，而且能诱导NASP细胞向成骨细胞分化.结论：bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞；bFGF能增加骨细胞的数量，促进骨样组织形式。     

Cell Proliferation Markers and Growth Factors in Ovarian Cancer

Results from our studies on the clinical applicability of proliferation markers and growth factors in the histopathological assessment of malignancy and prognosis of ovarian neoplasms are presented. Bromodeoxyuridine incorporation, Ki 67 antigen visualization and proliferation cell nuclear antigen expression indicated location and extent of cell proliferation, though not uniformly as compared to flow cytometry and mitotic counting. Clinicopathological correlations of the occurrence of programmed cell death, apoptosis, as indicated by morphology gave inconclusive results, as did analysis of Bcl-2 expression. Increased visualization of p53 protein was associated with increased degree of malignancy but was inconsistent in individual specimens. Growth factor expression, in particular transforming growth factor beta staining intensity, gave additional information on cell behaviour as did vascular endothelial growth factor distribution on vascularization and vessel neoformation when compared to platelet derived growth factor expression, useful in isolated specimens, and to basic fibroblast growth factor expression. The markers presented are indispensible in certain tumour types and give additional information improving our understanding of ovarian neoplasms and tumour classification in general but are mostly not yet reliable enough for clinically applicable conclusions of individual patients.     

成骨生长肽羧基端片段及其衍生物对骨髓抑制小鼠造血系统的影响

目的:初步观察成骨生长肽羧基端片段[OGP(10-14)]及其衍生物G38I、G38K对环磷酰胺(CTX)诱导骨髓抑制小鼠造血系统的影响.方法:40只小鼠随机分为5组,经注射CTX诱导骨髓抑制.分别给予OGP(10-14)、G38I、G38K或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗,未治疗的CTX组为阴性对照.分别于第1、7、10、14天测定小鼠外周血象并于注射CTX后第7天处死.观察外周血干细胞抗原-1(Sca-1)阳性细胞比例和骨髓有核细胞数.结果:注射CTX可诱导小鼠出现骨髓抑制.注射CTX前OGP(10-14)及其衍生物对小鼠外周血象无明显作用(P>0.05).注射CTX后OGP(10-14)组和G38I组外周血白细胞较CTX组显著升高(P<0.01),疗效与G-CSF接近,G38I组和G38K组血小板升高(P<0.01).各药物治疗组外周血Sca-1阳性细胞百分比和骨髓有核细胞数显著提高(P<0.05,P<0.01).结论:OGP(10-14)及其衍生物G38I、G38K可升高骨髓抑制小鼠外周血白细胞和血小板的数量,动员造血干细胞,对骨髓造血功能的恢复起到积极作用.     

bFGF缓释微球对骨髓间充质干细胞增殖作用的实验研究

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对兔骨髓基质干细胞(BMSC)增殖的长期效应。方法:在细胞培养技术下,不加bFGF或将游离bFGF或bFGF-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球加入第二代兔骨髓间充质干细胞培养液中,用细胞计数法、四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MTT法)、流式细胞仪观察细胞在第1,2,4,7及10天增殖的状况,并进行统计学分析。结果:培养1d后,三组细胞计数、吸光度(OD)值差异均无显著性意义;2d时,bFGF组的MSCs细胞数高于其余二组,差异有显著性意义(q检验,P<0.05);4d时,各组MSCs细胞依次为:PLGA微球组>bFGF组>空白对照组,各组间差异均有显著性意义(q检验,P<0.05);培养7d、10d时,微球组与上述两组仍有显著性差异。流式细胞仪检测显示,培养2d时,bFGF组的G2/M+S数百分数最高,4d后PLGA微球组G2/M+S数百分数最高。结论:微球通过较长时间持续释放活性bFGF,能长期显著地促进兔骨髓间充质干细胞的增殖。     

肝细胞生长因子对人胃癌细胞株AGS增殖的促进作用

目的:肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种多肽生长因子,具有促进细胞增殖、诱导细胞迁移和形态改变的作用。本研究探讨HGF对人胃癌细胞株AGS增殖的影响。方法:体外培养人胃癌细胞株AGS,应用浓度为25、50、75、100 ng/mL的HGF分别处理AGS细胞24 h、48 h、72 h,采用CCK-8法检测AGS细胞的增殖情况。结果:CCK-8法检测结果显示,不同浓度的HGF对AGS细胞均有促增殖作用,随着HGF浓度的增加或作用时间的延长,细胞增殖活力呈上升趋势,在72 h最为明显,呈时间、浓度依赖关系(t为3.89、5.28、9.73、11.00,P0.01)。结论:HGF能显著促进人胃癌细胞株AGS的增殖。