人NR4A1基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的:克隆人NR4A1基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR的方法从人卵巢组织中扩增NR4A1基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdtrack-NR4A1。PmeI酶切pAdtrack-NR4A1,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-NR4A1后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。PCR、Western blot检测NR4A1基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人卵巢组织中扩增出1797bp的cDNA,测序证实为人NR4A1基因。构建了NR4A1基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论:成功地克隆了人NR4A1基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究NR4A1基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。     

MEK5基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEK5的表达抑制

目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠...     

人TH基因重组腺病毒的构建及生物学活性研究

将人酪氨酸羟化酶cDNA表达盒克隆于质粒型腺病毒载体p△Elsp1A，得到重组质粒pAd－TH。随后用脂质体法将重组质粒pAd－TH和拯救型腺病毒质粒pBHG11一起共转染293细胞，通过体内同源重组生成重组腺病毒AdCMVth，THcDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。采用形态学、病毒核酸酶切和PCR／RT－PCR等方法进行鉴定正确。重组腺病毒滴度达到1010pfu／ml。初步结果表明，该重组腺病毒感染MN9D细胞后可使细胞内多巴胺水平增加1倍，显示出明显的TH生物学活性。提示TH重组腺病毒AdCMVth可作为高效的基因转移载体用于帕金森氏病基因治疗。     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。 目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。 方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1 080 bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。 结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的表达和生物学活性检测

目的探讨人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体（Adeno—TrkC）在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用。方法用RT-PCR检测Adeno—TrkC感染的293细胞的TrkCmRNA含量。用免疫细胞化学和Western blotting检测Adeno—TrkC感染的神经干细胞表达TrkC受体蛋白。在体外培养条件下,观察人神经营养素-3（NT-3）对感染了Adeno—TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响。结果在Adeno—TrkC感染的293细胞和神经干细胞中检测到TrkCmRNA和TrkC受体蛋白,且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞,分化率达到55．2％,均高于其他对照组。结论Adeno-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白．这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用,这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原S基因在人5型重组腺病毒中的表达及其特性

The hepatitis B virus (HBV) S gene, PreS2 + S genes and the late phase expression cassette (MTI) + HBV S genes were separately cloned into Ad5 vector downstream of E3 promoter (pAd5 deltaE3 provided by Wyeth Co.). The above constructed plasmids and Ad5 DNA EcoR I A fragment were cotransfected into 293 cells. The progeny adenoviruses named rAd5S, rAd5MS, rAd5S2S were harvested for analysis. The recombinants were isolated and analyzed by PCR, using two primers specific to the HBV S genes. The expressed products were detected by ELISA and RIA. The recombinant containing MIT + HBV S genes (rAd5MS) was identified to be ELISA positive, whereas the other two recombinants (rAd5S, rAd5S2S) were negative to ELISA, but positive to RIA. The results indicated that adenovirus E3 early promoter could express the inserted foreign genes, and MIT worked well in the E3 region of Ad5 and could increase the expression capacity of the recombinants. The conditions for foreign gene expression and genetic stability of the recombinant viruses were studied in detail. There was no wild Ad5 discovered during the cotransfection experiments. The present study provides some experiences for studying adenovirus recombination.     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染HEK293T细胞包装病毒。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达。结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400bp插入片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×108pfu/mL;重组病毒感染后,HEK293T细胞中IL-16 mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定

目的 制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒.方法 酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2.RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达.结果 酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装.在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达.制备的Ad- NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达.结论 成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据.     

表达人IL-17F重组腺病毒载体的构建及其表达产物的功能研究

目的构建表达人白细胞介素IL-17F （hIL-17F）的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F），为进行hIL-17F基因表达抑制血管形成和抑瘤效应的研究奠定基础。方法以pUCm-T/hIL-17F重组质粒为模板PCR扩增hIL-17F，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV转移质粒上，PmeⅠ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-hIL-17F，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，经同源重组，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-hIL-17F经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞，收获Ad-hIL-17F，用RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定人IL-17F基因表达。 MTT法检测hIL-17F基因表达对ECV304细胞的生长抑制作用， ELISA法检测人血管内皮生长因子（ VEGF）和血管生成素（ Ang-1）基因在293A细胞、ECV304细胞中的表达水平；实时定量RT-PCR检测Ad-hIL-17F对293A细胞中人VEGF转录的影响。结果测序显示hIL-17F序列正确，RT-PCR和间接免疫荧光法检测到了IL-17 F基因的表达。 Ad-hIL-17 F能显著抑制ECV304细胞的生长，抑制人VEGF和Ang-1基因在293 A细胞、ECV304细胞中的表达。结论成功构建和获得了hIL-17F的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F）， Ad-hIL-17 F可通过下调VEGF和Ang-1的分泌而抑制血管形成。     

突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体.方法:首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原eDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点,使突变的eDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS-M2;最后将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体.结果:HindⅢ和Xho I酶切、Poc I酶切及测序均证实载体pAd-INS-M2构建成功.结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd-INS-M2为进一步转染非胰岛β细胞,对糖尿病进行基因治疗奠定了基础.     

人CUL4A重组腺病毒载体的构建及其在PC-12细胞中的表达特点

目的 构建并鉴定带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的人源CUL4A(hCUL4A)基因腺病毒表达载体Ad-hCUL4A-GFP,探求hCUL4A在PC-12细胞中的表达特点.方法 扩增hCUL4A基因,并通过In-Fusion PCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315-EGFP-hCUL4A,利用AdMaxTM腺病毒包装...     

EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达

目的 :构建EB病毒潜伏期膜蛋白 2A重组腺病毒 ,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗。方法 :利用RT PCR扩增出EB病毒B95 8株潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因 ,并克隆至pGEM T载体中。并将LMP2AcDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW ,选择正确的克隆pAX1CW LMP2A与Ad5DNA 末端肽复合体共转染 2 93细胞 ,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒。提取重组腺病毒转染的 2 93细胞DNA ,通过酶切初步鉴定。选择阳性克隆感染CV1细胞 ,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况。结果 :挑选同源重组 17个克隆中有 9个为阳性克隆 ,扩增到的病毒滴度为 2 3× 10 8pfu/ml。用MOI =10 0的重组腺病毒感染CV1细胞 ,48h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上 ,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为 94 4 %。结论 :重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达 ,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础。     

人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备人微小RNA-16（miR-16）重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）中的表达及对细胞周期素依赖蛋白激酶6（CDK6）表达的影响。方法从人基因组DNA中扩增miR-16前体的DNA,定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经PmeⅠ线性化的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-16与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,在细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒rAdTrack-miR-16。将经PacⅠ线性化的rAdTrack-miR-16在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-16的重组腺病毒rAd-miR-16。将重组腺病毒感染hMSCs,分别检测miR-16前体和miR-16靶基因CDK6的表达。结果 pAdTrack-CMV-miR-16构建正确,在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-16。rAd-miR-16感染的hMSCs中miR-16前体水平显著升高（P〈0.05）,CDK6mRNA的表达降低不明显,CDK6蛋白表达水平显著降低（P〈0.01）。结论成功制备了表达人miR-16的重组腺病毒,并能有效介导miR-16在hMSCs中的表达,为进行miR-16的功能研究创造了条件。     

细菌内同源重组高效制备含绿色荧光蛋白和抗凋亡基因bcl-XL的重组腺病毒载体

目的:制备含绿色荧光蛋白和抗凋亡基因bcl-X_L的重组腺病毒载体。方法:采用PCR方法从质粒pEGFP-C3-bcl-X_L中扩增出bcl-X_L基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-bcl-X_L;然后与pAdEasy-1共转化BJ5183菌,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-gfp-bcl-X_L,筛选同源重组的阳性克隆;抽提的pAdEasy-1-gfp-bcl-X_L经PacI线性化后,再用LIPOFECTAMINE^TM2000介导转染至人胚肾293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒;采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定;用氯化铯超高速梯度离心纯化获取高滴度的重组腺病毒rAd-gfp-bcl-X_L。结果:由pAdTrack-CMV-bcl-X_L和pAdEasy-1共转化BJ5183菌16-20h后,可获得35%的阳性重组体细菌克隆。由重组质粒DNA经293细胞包装后产生的重组腺病毒,经PCR检测表明含有目的基因bcl-X_L。氯化铯纯化所得重组腺病毒滴度约为65×10¹²PFU/L。结论:用细菌内同源重组法可以高效、简便、快捷地制备出重组腺病毒质粒载体,重组体病毒质粒经293细胞包装、扩增和氯化铯纯化后可制备出高滴度的重组腺病毒颗粒rAd-gfp-bcl-X_L,为人类相关疾病的基因治疗提供良好的基因转染载体。     

人GDF-5重组腺病毒载体的构建及其在人间充质干细胞中的表达

本研究目的在于构建携带GDF-5基因的重组腺病毒表达载体,并用其感染人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)研究GDF-5的表达。从含有人GDF-5基因核心序列的质粒pCMV-SPORT6上通过PCR扩增GDF-5,将其酶切连接到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183中和骨架质粒pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆并酶切鉴定,线性化后磷酸钙法转染入人胚肾293细胞中包装、扩增,得到含有GDF-5基因的重组腺病毒并测定其滴度。用收集的腺病毒感染靶细胞MSCs,在基因水平检测GDF-5的表达情况。结果表明,成功构建了含有GDF-5基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为1×109PFU/ml。重组腺病毒能有效感染MSCs并表达目的基因。通过构建该腺病毒并感染人MSCs可得到能持续一定时间表达GDF-5蛋白的MSCs,为这种转基因的MSCs进一步修复组织奠定了基础。     

过表达大鼠TIPE2基因重组腺病毒载体的构建

背景：TIPE2抗炎蛋白,通过对T细胞受体(TCR)和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节,从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用,有效地维持机体内环境的稳定。目的：使用人工合成腺病毒载体构建能过表达大鼠TIPE2基因的重组腺病毒。　方法：利用RT-PCR的方法,从大鼠淋巴细胞中扩增出大鼠TIPE2基因,克隆到穿梭质粒pShuttle-clontech的表达框中,然后将包含TIPE2的完整表达框,进一步亚克隆到黑猩猩来源的腺病毒包装载体AdC68,转染HEK 293A细胞,包装出重组腺病毒。并以其感染HEK293A细胞,采用western blotting方法检测TIPE2基因的表达水平。　结果与结论：PCR扩增、酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为TIPE2的蛋白编码基因,western blotting结果表明,重组腺病毒能可高效表达TIPE2基因。说明成功完成AdC68-TIPE2重组腺病毒的构建,该腺病毒载体,能稳定表达大鼠TIPE2基因。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 ,为进一步实现其在雪旺细胞中可调控的高效表达奠定了基础