体外诱导兔胚胎干细胞分化为神经细胞

目的:探讨体外诱导兔胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的方法。方法:应用多种诱导剂联合诱导兔ESCs,免疫荧光和流式细胞仪检测巢蛋白(Nestin)的表达。结果:诱导后兔ESCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,Nestin阳性表达。结论:在体外采用定向分化诱导,兔ESCs可直接定向分化为神经干细胞。     

体外培养胚胎干细胞分化为心肌细胞特性的初步研究

目的了解干细胞在实验条件下分化发育为心肌细胞的特征表达与培养时间的关系。方法收集体外培养条件下第2、4、6、8、10、12、14、16、18和20天的胚胎干细胞,采用RT-PCR方法对其中心肌细胞特异表达基因(浕/β-MHC)的表达量进行检测,并通过管家基因(GAPDH)表达量作为内对照;另外收集第0、3、5、10天培养的干细胞,检测3种管家基因(GAPDH、HGPRT、β-tublin)表达的稳定性。结果胚胎干细胞在体外特定培养条件下,第6天起浕/βMHC出现,且表达量随培养时间延长逐渐增加,至14天时表达量最高,其后随着培养时间延长,表达量保持稳定;不同管家基因表达量随培养时间的变化,稳定性相差较大,其中GAPDH基因表达的波动相对稳定。结论EST实验体系分化抑制实验的周期设计为10~14天较为合理,GAPDH适合用于作为目的基因表达量检测的内对照。     

胚胎干细胞的分化研究

胚胎干细胞的分化研究已成为发育生物学和临床细胞替代治疗的研究热点。本文仅就胚胎干细胞分化的理论基础、定向分化研究现状及临床潜在应用价值作一综述。     

胚胎干细胞的分化研究

胚胎干细胞的分化研究已成为发育生物学和临床细胞替代治疗的研究热点。本文仅就胚胎干细胞分化的理论基础、定向分化研究现状及临床潜在应用价值作一综述。     

药物介导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞

[目的 ]胚胎干细胞 (embryonicstemcells ,ES细胞 )是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离出来的全能细胞系 ,具有体外不分化的无限增殖能力 ,当处于适合的培养条件下 ,可定向分化形成多种单一的细胞。本研究利用ES细胞的这种特性 ,旨在构建一种可提供生物信息量大而专一性强的体外药物筛选和安全性评价模型。由于ES细胞体外定向分化模型重演了基因按照特定的时间、空间表达的过程。在与药物共培养的过程中 ,ES细胞定向分化模型提供了药物介导机体生理、病理情况下生命现象的所有生物信息。基于ES细胞具有的全能性 ,用以筛选某种特定作用的药物时 ,在其定向分化为某一特定细胞过程中 ,可采集到核酸层面和蛋白层面的生物信息及其转录、翻译过程中的信号转导和修饰过程。 [方法 ]以小鼠ES细胞作为生物测试载体 ,将ES细胞用胰酶消化后 ,以合适的密度制成单细胞悬液 ,采用悬滴培养方法和特定的药物改变其培养微环境进行分化培养。 [结果 ]按上述方法经过约 13d的培养 ,先后分两批定向分化出 30余个具有自律性搏动的心肌细胞团。其搏动频率有差异 ,范围在 80～ 130次 /min之间 ,各细胞团搏动的节律非常有规则 ,以搏动频率与节律作为评价指标 ,定向分化成功率达 80 %以上。 [结论 ]本研究构建了小鼠ES细胞体外定向     

胚胎干细胞体外分化为原始生殖细胞与精子

胚胎干细胞（ESC）是全能干细胞，理论上讲可分化为全部生殖层的所有组织细胞包括生殖母细胞．进而分化出成熟精子。结合最近研究进展对胚胎干细胞体外分化为原始生殖细胞（PGC）。进而分化出可使成熟卵母细胞受精的精子，以及胚胎干细胞和由胚胎干细胞体外分化的原始生殖细胞（PGC）和精子的鉴定，以及促进ESC体外分化为PGC的影响因素和ESC体外分化为精子的意义和存在的问题做一综述。     

胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎肝细胞提取液体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化的可行性。方法通过密度梯度分离法分离出骨髓中单个核细胞,进行体外培养和鉴定。在BMSCs传代培养7d后,把培养细胞分为诱导组和非诱导组;诱导组加入胚胎肝细胞提取液的培养体系,非诱导组加入不含胚胎肝细胞提取液的基础培养体系。在诱导培养d0,d10,d20,d30,d40对诱导分化的细胞进行形态学观察、肝系细胞特异性标志物的鉴定。结果①形态学:诱导培养2周后,长梭形细胞大多数转变成圆形、卵圆形及多角形,细胞呈肝干细胞样圆形。②免疫细胞化学检测:诱导培养d10～20细胞表达AFP、CKl9逐渐增强,d30~40逐渐减弱;诱导培养d10~40细胞表达ALB呈上升趋势;阳性染色细胞胞浆内出现棕黄色颗粒。非诱导组细胞不表达AFP、CKl9、ALB3种蛋白,为阴性染色。③糖原染色:诱导培养的细胞d10~40BMSCs均有糖原表达,非诱导细胞未见糖原表达(P﹤0.05)。结论胚胎肝细胞提取液在体外可以诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化,并分化为具有合成、代谢、分泌及储存功能的肝系细胞。     

胚胎干细胞体外分化为原始生殖细胞与精子

胚胎干细胞(ESC)是全能干细胞,理论上讲可分化为全部生殖层的所有组织细胞包括生殖母细胞,进而分化出成熟精子.结合最近研究进展对胚胎干细胞体外分化为原始生殖细胞(PGC),进而分化出可使成熟卵母细胞受精的精子,以及胚胎干细胞和由胚胎干细胞体外分化的原始生殖细胞(PGC)和精子的鉴定,以及促进ESC体外分化为PGC的影响因素和ESC体外分化为精子的意义和存在的问题做一综述.     

诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究综述

脐血间克质干细胞是指从脐带血中分离、培养出来的一种成体肝细胞,具有多潜能性,可以向神经细胞分化。临床研究发现,脐血间充质干细胞于神经损伤、神经退行性疾病、卒中等神经系统疾病临床治疗中具有显著功效。近年来,关于脐血间充质干细胞相关研究工作不断推进,取得了多项研究成果。本文着重针对诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞问题进行了分析总结。     

苯乙基异硫氰酸盐对小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞过程中基因表达影响的研究

目的探讨苯乙基异硫氰酸盐(PEITC)对小鼠胚胎干细胞(mESCs)体外定向诱导分化为神经样细胞中PKCα及其相关发育基因(pax-6、netrin-1)表达的影响。方法mESCs经RA法诱导后,第7天用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因等神经细胞特异性标志物。不同浓度PEITC作用条件下,分别取诱导后1、3、5、7及14天后的细胞,用RT-PCR方法测定细胞的PKCα及其相关发育基因pax-6和netrin-1的mRNA表达情况。结果诱导后第7天,分化的神经样细胞中nestin、glutaminase、Brn-3基因均高表达。正常诱导1天后,PKCα、pax-6和netrin-1基因的mRNA表达急剧下降,3、5、7天逐渐升高,至14天恢复至正常水平。PEITC作用下,PKCα、pax-6、netrin-1的mRNA在诱导后细胞中各阶段的表达水平与正常诱导条件下相比均下降,且随着作用浓度和作用时间的增加,下降趋势明显。结论PEITC对mESCs定向分化为神经样细胞过程中相关发育基因(pax-6、netrin-1)的表达的干扰作用可能与抑制PKCα的表达有关。     

BRL-CM小鼠胚胎干细胞及体外诱导的研究

目的 探讨以Buffalo大鼠肝细胞培养上清(BRL-CM)替代含LIF培养液体外培养小鼠胚胎干细胞(ESC)的可行性；无血清体外诱导ESC为神经前体细胞(NPC)。方法 以BRL-CM维持ESC生长并抑制其分化，用含LIF的培养液作为对照，硝基四氮唑蓝／5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸(NBT／BCIP)显色检测碱性磷酸酶。采用N2选择性无血清培养法获取NPC，免疫组化法检测巢蛋白(Nestin)鉴定。结果 BRL-CM与含LIP的培养液一样能维持ESC未分化状态，无血清培养基诱导。ESC后获得细胞的86％为NPC。结论 BRL-CM可替代LIF用于ESC培养，且经济、简便。采用N2选择性培养基可获得较高纯度的NPC。     

胚胎干细胞实验模型在发育毒性评价中有效性的初步研究

目的依据胚胎干细胞具有向心肌细胞分化的能力,建立体外分化发育毒性评价的模型,并对其判定受试物发育毒性强弱的有效性进行验证。方法利用悬滴、悬浮培养方法,通过不同浓度青霉素G、苯妥英钠和氟尿嘧啶作用,检测胚胎干细胞分化为心肌细胞的能力,结合MTT法获得的受试物细胞毒性结果,判断受试物的发育毒性。结果青霉素G、苯妥英钠和氟尿嘧啶的ID50(D3)分别为1099、47.4和0.023μg/ml,其发育毒性的判定依次无、弱和强。结论建立的胚胎干细胞实验模型能够判定氟尿嘧啶、苯妥英钠和青霉素G发育毒性,结果与ECVAM的结论一致,可用于发育毒性的筛选和评价。     

尼古丁对小鼠胚胎干细胞特异基因Oct-4转录的影响

目的　通过尼古丁对小鼠胚胎干细胞 (EmbryonicStem ,ES)特异基因Oct 4转录的影响来探讨尼古丁是否影响早期胚胎发育。方法　ES细胞选用饲养层培养法 ,尼古丁 (1～ 10 0 0nmol L)和 或 10 μmol L筒箭毒 (尼古丁乙酰胆碱受体阻断剂 )作用 2 4h后 ,纯化ES细胞 ,提取总RNA。首先扩增Fgf 5以观察纯化后ES细胞的纯度 ;同时用半定量RT PCR法观察尼古丁对Oct 4和 β actin表达的影响 ,及筒箭毒对尼古丁作用的影响。结果　尼古丁对β actin转录没有明显的影响 ,而可明显的增强Oct 4的转录 ;筒箭毒单独作用ES细胞可提高Oct 4的转录 ,而在尼古丁同时存在的情况下 ,筒箭毒对Oct 4的作用将随着尼古丁浓度的增加而减弱 ,当尼古丁的浓度为 10 0～ 10 0 0nmol L时 ,筒箭毒可明显抑制尼古丁诱导的Oct 4的表达。结论　研究表明 ,Oct 4的转录水平和胚胎干细胞的命运密切相关 ,维持胚胎干细胞的未分化状态需要Oct 4保持相对恒定的转录水平。因而 ,尼古丁对Oct 4转录的影响可能会影响胚胎干细胞的发育和分化 ,从而影响胚胎的早期发育     

Differentiation of stem cells upon deprivation of exogenous FGF2: a general approach to study spontaneous differentiation of hESCs in vitro

Establishing a model for in vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) towards the germ cell lineage could be used to identify molecular mechanisms behind germ cell differentiation that may help in understanding human infertility. Here, we evaluate whether a lack of exogenous fibroblast growth factor 2 (FGF2) is supporting spontaneous differentiation of hESCs cultured on human foreskin fibroblast (hFF) monolayers towards germ cell lineage. Additionally to depriving the hESCs of exogenous FGF2, cells were stimulated with all-trans retinoic acid (ATRA). To get a more comprehensive impression on effects of removal of FGF2 and stimulation with ATRA, we combined the results of three cell lines for each experimental setting. When combining gene expression profiles of three cell lines for 96 genes, only 6 genes showed a significant up-regulation in all cell lines, when no FGF2 was added to the media for 12 weeks. None of these genes are related to the germ lineage, whereas genes for neuronal cells (PAX6 and NR6A1) and endothelial cells (FLT-1 and PTF1A) were up-regulated. To induce and support the differentiation towards the germ lineage we stimulated hESCs with different concentrations of ATRA for 7 and 14 days. We observed no significant difference in gene expression on RNA level when combining all cell lines. Whereas, the overall outcome was negative, one of these cell lines demonstrated an up-regulation of DDX4 on RNA and protein level after 7 days of ATRA stimulation. In summary, our data showed that the lack of exogenous FGF2 results in up-regulation of genes crucial for neuronal and endothelial cell differentiation of hESCs, but not in the up-regulation of genes related to germ cell differentiation when cultured on hFFs. Additionally, we demonstrated that ATRA supplementation did not result in a general specific direction of hESCs towards the germ lineage.     

人胎脑神经干细胞增殖分化的形态学观察

【目的】从32周人胎脑纹状体中分离培养神经干细胞并观察其增殖分化潜能,旨在为中枢神经系统的移植治疗寻找更广阔的材料。【方法】采用无血清培养和单细胞克隆技术,从32周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察。【结果】从32周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞具有神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的形态。【结论】32周人胎脑纹状体能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

视黄酸阻滞胎鼠腭间质细胞周期进程并诱导凋亡

目的探讨全反式视黄酸(atRA)对小鼠胚胎腭间质细胞(MEPM)细胞增殖和细胞周期的影响及其分子生物学作用机制。方法MEPM细胞取材于孕13d胎鼠腭组织。MTT比色法检测atRA对MEPM细胞增殖活力的影响;流式细胞术分析atRA对细胞周期分布的影响,并同时观察有无细胞凋亡现象发生;Western-blot检测atRA对细胞周期蛋白D和E表达的影响,并观察对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化的影响。结果与溶剂对照组相比,在5~10μmol/L浓度范围内,atRA能够显著性抑制MEPM细胞增殖活力(P<0.05),并将细胞周期滞留在G0/G1期(P<0.05)。atRA对细胞周期蛋白D和E的表达及相应酶活性均表现为抑制效应。观察Rb的变化也显示,atRA降低Rb的磷酸化作用。结论atRA对腭器官发育敏感期腭间质细胞增殖活力及细胞周期的抑制作用可能是atRA诱导诱导唇腭裂的机制之一。