白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的：探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法：将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti，电击转化毕赤酵母菌株X-33，用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果：转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI；培养上清中rBPTI含量约200 mg• L^-1；SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508；rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致；胰蛋白酶活性抑制分析结果表明，抑制常数Ki＝（2.6±0.1）×10^-9,与天然BPTI一致。结论：hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg• L^-1。     

信号肽序列在酵母分泌表达系统中的应用

酵母是一个近年来被广泛使用的真核表达系统,应用信号肽序列构建酵母分泌表达系统,即可方便纯化操作,又可提高外源蛋白的分泌表达效率。本文将从信号肽结构特征、常用的信号肽序列以及构建高分泌型载体等方面进行综述。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的，极具潜力的真核表达系统，具有其他系统不可比拟的优点，在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达

头孢菌素C(CPC)酰化酶可用于一步酶法合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。对来自Pseudomonas sp. Strain SE83的高活性CPC酰化酶突变基因进行基于毕赤酵母偏好密码子优化,获得基因SECA。选取毕赤酵母内源信号肽DSE4,构建表达菌G/DSECA,首次在毕赤酵母中分泌了CPC酰化酶。与酿酒酵母α-交配因子前导肽(α-factor)相比,DSE4介导SECA的分泌表达效果更优,其介导SECA表达的胞内、外单位体积酶活分别比α-factor高65%和44%。分别以DSE4和α-factor为信号肽构建β-半乳糖苷酶表达菌G/DSEL与G/MFL,进一步考察DSE4介导异源蛋白的分泌效果,G/DSEL的胞内外单位体积酶活也均高于G/MFL。     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

人抑制素M突变体在毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:构建重组人抑瘤素M突变体(Recombinant human mutant oncostatin M,rhMut-OSM)毕赤酵母分泌表达菌株.方法:将人抑瘤素M蛋白成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,同时将100位和217位Asn突变成Glu,消除糖基化位点,人工合成人抑瘤素突变体基因.将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体DPIC9-rhMut-OSM,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhMut-OSM的酵母工程菌.结果:培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为22kD的rhMut-OSM,实现了非糖基化表达,表达量高峰出现在诱导72h后,摇瓶表达量为400mg/L.结论:成功构建了重组人抑瘤素突变体毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达rhMut-OSM.     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原（SS—B）。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法（immunodot）鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，pPIC9k—SS—B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS—B的分子量约48000，高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。表达量占分泌总蛋白60％以上。产物浓度为800—900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

胱抑素C在巴斯德毕赤酵母的高效分泌表达及免疫原性分析

目的根据巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)密码子的偏好,将人胱抑素C(CysC)基因进行密码子优化,在P.pastoris中表达CysC,并对重组蛋白进行生物学活性评价。方法按照P.pastoris表达系统密码子偏好,优化基因序列,人工合成完整的基因;构建pPIC9k-CysC重组表达质粒,用电穿孔法转化P.pastoris GS115,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,取培养物上清液,经SDS-PAGE电泳和颗粒增强透射免疫比浊法鉴定表达情况。经Western blot和动物实验鉴定重组蛋白的免疫原性。结果表达产物相对分子质量约19 000,优化后的人CysC基因在P.pastoris转化菌得到了高效表达,表达量占分泌总蛋白的80%以上,产物浓度为600～950mg/L。Western blot和动物实验显示重组蛋白具有较好的免疫原性。结论密码子优化后CysC在P.pastoris中获得高效分泌表达,可用于制备抗血清和诊断试剂标准品。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统，该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点，而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述。     

人瘦素在毕赤酵母中的表达及其分离纯化

目的:为了获得人(瘦素或瘦蛋白)而进一步研究其生理作用、作用机制与病理意义。Leptin方法:采用逆转录-聚合酶链反应()方法,从人腹部皮下脂肪组织中分离脂肪细胞总,经逆转录、扩增出肥胖基因的编码序列RT-PCRRNAPCR(基因),再克隆到表达载体α中,在毕赤酵母菌株中表达。ObcDNApPICZGS115结果:的扩增产物长度为,克PCR462bp隆后的表达产物,经证实,约为分子量为的特异蛋白条带,与人瘦素的理论预计值相符合,经放免法测定,SDS-PAGE17kD表达量达到。通过其多聚组氨酸接头与金属镍螯合的亲和层析法纯化表达蛋白,在上呈现分子量为的36mg/LSDS-PAGE17kD单一蛋白条带。结论:通过基因工程手段已成功表达出人瘦素并分离纯化得到纯度较高的人瘦素。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

毕赤酵母高效表达外源基因的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一[1,2].酵母被认为是一个很有前途的真核表达系统而受到广泛的关注.本文综述了Pp在生物学特性、遗传学特征、载体、基因整合、胞内表达和分泌表达、影响外源蛋白在Pp表达系统中高效生产因素的研究进展.     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。