大鼠窦状卵泡颗粒细胞中磷酸化蛋白激酶B表达与凋亡的关系

目的探讨大鼠窦状卵泡中磷酸化蛋白激酶B(PKB,又称Akt)的表达与卵泡颗粒细胞凋亡之间的关系。方法应用免疫组织化学法和Western blot法检测磷酸化Akt(phosphorylation-Akt,p-Akt)在大鼠不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达,应用TUNEL法检测成年大鼠卵泡颗粒细胞的凋亡情况。结果在大鼠窦前及窦状卵泡的颗粒细胞中,p-Akt表达高的颗粒细胞凋亡程度较轻,而p-Akt低表达的颗粒细胞凋亡现象较明显。结论 p-Akt的高表达在一定程度上与颗粒细胞凋亡受抑制有关,并有可能参与了窦状卵泡阶段卵泡的闭锁的选择。     

转化生长因子β信号通路对卵泡刺激素调节卵巢颗粒细胞功能的影响

目的 探讨大鼠卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素(FSH)和转化生长因子β(TGF-β)信号通路之间的相互作用.方法 取21 dSD大鼠卵泡分离的颗粒细胞原代培养,实验分为对照组、FSH处理组和转化生长因子β Ⅱ型受体(TGF-β R Ⅱ)中和组.通过免疫细胞化学和Western blotting定位和检测TGF-β R Ⅱ以及...     

Kisspeptin/kiss1r系统在多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及其对卵泡发育障碍的可能作用机制

目的:探讨多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢中kisspeptin/kisslr系统的表达及其对PCOS大鼠卵泡发育障碍的可能作用机制。方法:构建PCOS大鼠模型;免疫组织化学检测实验大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r的表达;免疫印迹和qRTPCR分别检测kisspeptin/kisslr蛋白和mRNA水平。结果:与正常组相比,PCOS组的体质量及卵巢质量明显增加,血清雄激素、黄体生成素水平明显增加,卵泡刺激素水平变化无统计学差异。PCOS大鼠卵巢中含有较多发育早期的小卵泡及闭锁卵泡,囊状扩张卵泡明显增加,颗粒细胞层数减少至2~3层,黄体数量明显下降;kisspeptin/kisslr蛋白和mRNA水平明显降低。结论:卵巢表达的kisspeptin/kisslr在PCOS大鼠卵泡发育障碍中可能通过调节颗粒细胞发挥作用,本研究将为进一步探讨PCOS的发病机制提供一定的理论基础。     

脑源性神经营养因子及其受体在人卵巢的表达与卵泡发育的关系

目的：研究脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体——酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)在人卵巢中的表达。初步探讨其与卵泡发育的关系。方法：取排卵前期人卵巢组织和来自体外受精．胚胎移植(IVF-ET)周期的取卵日卵泡液、人卵巢黄素化壁层颗粒细胞(hMGLCs)、人卵巢黄素化卵丘颗粒细胞(hCGLCs)、未受精卵母细胞或未成熟卵母细胞。用免疫组织化学SABC法研究BDNF在人卵巢组织中不同发育阶段卵泡的表达，酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测BDNF在人卵泡液，hMGLCs和hCGLCs无血清培养上清液中的表达。用免疫组织化学SABC法研究TrkB在人卵巢组织不同发育阶段卵泡的表达，免疫细胞化学SABC法研究TrkB在hMGLCs，hCGLCs和未受精或未成熟卵母细胞的表达，Western blotting方法检测TrkB在hMGLCs和hCGLCs的表达及其差异。结果：人卵泡液中存在BDNF，BDNF表达于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞及窦状卵泡的卵丘颗粒细胞。TrkB表达于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞、窦状细胞的卵丘颗粒细胞、壁层颗粒细胞及卵母细胞，壁层颗粒细胞表达量高于卵丘颗粒细胞。结论：在人卵巢BDNF及其受体TrkB可能(通过旁分泌和自分泌的方式)参与颗粒细胞功能的完成和卵母细胞发育的调控。     

前列腺素E1对大鼠卵泡壁发育和分化影响的形态学观察

本文应用组织学方法和电镜对PGE1引起未成熟大鼠卵泡颗粒细胞和卵泡膜外层细胞的形态学变化作了研究。结果表明:外源性PGE1刺激了颗粒细胞的发育和黄体化,同时也促进了卵泡膜外层细胞的发育和从成纤维细胞向平滑肌细胞分化。文中对有关PGE1在排卵过程中的作用机制等问题进行了讨论。     

干细胞相关因子在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达

背景：现有研究表明,人与大鼠卵巢优势卵泡中的颗粒细胞具有表达干细胞特性的现象。 目的：探讨干细胞相关因子在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达。 方法：将大鼠卵巢组织制作石蜡切片后,使用免疫组化法检测CD34,CD133,ABCG2/Bcrp1,Pou5f1/Oct-4的表达。卵泡穿刺法获取颗粒细胞,并使用免疫组化法检测FSHR受体的表达以鉴定颗粒细胞的纯度。免疫组化法检测颗粒细胞CD44,C-Kit的表达情况,RT-PCR检测卵巢组织与颗粒细胞ABCG2/Bcrp1、Pou5f1/Oct-4、Nanog基因的表达情况。 结果与结论：免疫组化法石蜡切片显示部分卵巢颗粒细胞CD34,CD133,ABCG2/Bcrp1,Pou5f1/Oct-4阳性表达,而Pou5f1/Oct-4蛋白的表达在卵泡发育的周期中逐步增多,并在黄体化的时候显著增强,形成白体后则消失,因而具有周期性表达的特点。卵泡穿刺法提取的原代颗粒细胞FSHR受体鉴定阳性率在95%以上。体外培养的颗粒细胞以长梭形或菱形为主,部分细胞有聚集生长现象,且CD44,C-Kit阳性表达。RT-PCR检测结果显示,卵巢组织与体外培养的颗粒细胞均不表达Nanog,卵巢低表达Pou5f1/Oct-4,强烈表达ABCG2/Bcrp1,颗粒细胞微弱表达Pou5f1/Oct-4,而ABCG2/Bcrp1表达较强。以上结果显示大鼠卵巢中的部分颗粒细胞具有干细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

角质细胞生长因子及其受体在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的分布

目的　探讨角质细胞生长因子 (KGF)及其受体 (KGFR)在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的表达。方法　采用原位杂交和免疫组化方法分别观察KGF、KGFR在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的分布。结果　KGFmRNA存在于正常人卵泡膜细胞和颗粒细胞中 ,KGFmRNA的表达为卵泡膜细胞高于颗粒细胞 (P <0 .0 5 ) ,KGFR的表达为颗粒细胞高于卵泡膜细胞 (P<0 .0 5 ) 。结论　人卵泡膜细胞分布有KGF ,颗粒细胞分布有KGFR ,两者可能存在旁分泌的调节作用。     

转化生长因子-β和Smad4在绝经过渡期大鼠卵巢颗粒细胞中的表达

目的 探讨转化生长因子-β（TGF-β）、Smad4 在绝经过渡期大鼠卵巢颗粒细胞中的表达,分析其与卵巢功能衰退的关系。 方法 雌性SD大鼠分为对照组（C组,6月龄,阴道涂片筛选,n=9）、绝经过渡期组（MT组,12~14月龄,阴道涂片筛选,n=8）,大鼠麻醉处死后迅速取出卵巢,采用机械分离方法释放卵泡颗粒细胞,于CO₂培养箱中培养,利用免疫细胞化学法检测促卵泡刺激素受体（FSHR）蛋白的表达,鉴定卵巢颗粒细胞;免疫细胞化学法检测TGF-β、Smad4蛋白在两组卵巢颗粒细胞的表达;采用Real-time PCR的方法检测各组颗粒细胞中TGF-β、Smad4 mRNA的表达。 结果 免疫细胞化学显示分离培养的颗粒细胞纯度＞95%,MT组TGF-β、Smad4蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）;Real-time PCR结果显示,两组均有TGF-β、Smad4 mRNA的表达,MT组TGF-β、Smad4 mRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）。 结论 TGF-β、Smad4参与绝经过渡期大鼠卵巢功能的衰退过程,绝经过渡期大鼠功能衰退的部分原因可能与卵巢颗粒细胞中TGF-β、Smad4 的表达降低有关。     

激活素A对离体培养大鼠卵泡发育的影响

激活素A是一种由卵泡液中提取出来的蛋白,主要以旁分泌和自分泌途径调节卵泡颗粒细胞功能,而对卵泡发育的影响却不十分清楚。本实验目的旨在探讨激活素A对大鼠离体培养卵泡发育的影响。用胶原酶分离窦前卵泡并分别加入激活素A（140μg/L)、FSH（0．1IU/mL)以及卵泡抑素（FS）在DMEM培养液中进行离体卵泡培养4d,观察卵泡直径、雌二醇分泌的变化。结果表明：激活素A处理组和FSH＋激活素处理组的卵泡直径显著增大（P＜0．01）。FSH＋激活素A处理组雌二醇的分泌显著增加。FS可抑制激活素A对卵泡发育的影响。结果显示：激活素A可以促进未成年大鼠窦前卵泡的生长发育。     

Htra1mRNA在PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及意义

目的探讨Htra1 mRNA在PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中的表达情况。方法皮下注射DHEA建立大鼠PCOS模型,并验证用RT-PCR方法及凝胶成像系统检测分析两组大鼠卵巢中Htra1的表达情况。结果与对照组比较,PCOS模型组血清雄激素(T),空腹血糖(FBG),空腹胰岛素(FINS)显著升高(P0.05)。卵巢切片HE染色显示:模型组卵巢有较多的囊状扩张卵泡,而发育阶段卵泡与颗粒细胞层数明显减少,未见黄体。对照组可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体;模型组卵巢组织Htra1 mRNA的表达显著低于对照组(P0.05)。结论高雄激素血症和高胰岛素血症可能导致Htra1表达减弱,Htra1的低表达可能与多囊卵巢综合征(PCOS)卵泡发育成熟障碍及不排卵有关。     

对正常动情周期大鼠卵巢颗粒细胞黄体化过程的电镜观察

用透射电镜和扫描电镜技术,对大鼠在动情周期中卵巢颗粒细胞的超微结构进行了超薄切片、割断扫描及冷冻复型观察。结果表明,从早期生长卵泡到成熟卵泡,颗粒细胞的核、细胞器及细胞连接均有改变,并发现颗粒细胞在排卵前已发生黄体化,胞质内出现管状嵴线粒体,滑面内质网(SER)广泛发育,出现电子密度较高的类脂滴。扫描电镜下可见细胞表面高度皱褶并伸出球形突起,细胞表面浮有絮状物。与动情期末(排卵后)功能黄体的颗粒细胞相比,明显不同,尤其是颗粒黄体细胞向细胞间隙突出大量球形泡,部分泡已破裂,并皱缩变扁。表明动情前期末颗粒细胞已开始合成并分泌类固醇激素,动情期末颗粒黄体细胞大量分泌类固醇激素。扫描电镜下所见的微顶浆分泌方式可能是大鼠卵巢类固醇激素分泌方式之一。     

双氢睾酮对大鼠原代卵泡颗粒细胞抗苗勒管激素表达的影响

目的 探讨双氢睾酮（DHT）对大鼠原代卵泡颗粒细胞抗苗勒管激素（AMH）表达的影响。方法 从95只21 d SD雌性大鼠中提取颗粒细胞原代培养48 h后,先用HE染色检测细胞形态,卵泡刺激素受体（FSHR）细胞免疫荧光检测细胞纯度;然后根据干预方法和实验的不同,随机将细胞分为对照组（无药物干预）、10^-8mol/L DHT组、10^-5mol/L DHT组,2×10^-5mol/ L蛋白激酶B(Akt)抑制剂（MK-2206 2Hcl）组和10^-8mol/L DHT+2×10^-5mol/L MK-2206 2Hcl组,分别使用相应浓度的试剂干预细胞3 h。干预完成后,细胞免疫荧光染色观察AMH表达的部位和变化;Western blotting测定不同组的AMH、Akt、p-Akt蛋白表达量。结果 大鼠原代卵泡颗粒细胞的纯度为93.33%±3.09%,AMH表达在大鼠原代卵泡颗粒细胞膜和细胞质中;与对照组相比,10-8 mol/L DHT和10-5 mol/L DHT均可使颗粒细胞AMH表达增加（P<0.05）,但这两个浓度的DHT对颗粒细胞AMH的表达影响差异无显著性（P>0.05）;与对照组相比,10^-8 mol/L DHT可以使p-Akt、AMH表达升高,2×10^-5 MK-2206 2Hcl使AMH表达降低（P<0.05）;与2×10^-5MK-2206 2Hcl相比,10^-8mol/L DHT+2×10^-5 MK-2206 2Hcl处理组AMH表达升高（P<0.05）。结论 DHT可以上调大鼠原代卵泡颗粒细胞AMH的表达,这种作用可能与Akt信号通路有关。     

宁心红杞胶囊对老龄雌性大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的影响

目的：观察天然药物干预下老龄雌性大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的变化。方法：以自然衰老雌性大鼠为实验模型,按临床等效剂量胃饲由天然植物药加工制成的宁心红杞胶囊8周后,取其卵泡中颗粒细胞,用透射电镜进行观察。结果：模型组颗粒细胞胞体变小,胞质中的各种细胞器和分泌颗粒数量明显减少,可见较多的凋亡细胞和凋亡小体。用药组细胞体积增大,胞质内细胞器数量增多,线粒体、滑面内质网、粗面内质网、高尔基复合体等结构大体正常,细胞间缝隙连接增多。偶见凋亡的颗粒细胞,未见凋亡小体。结论：宁心红杞胶囊具有调控颗粒细胞凋亡的作用,能抑制凋亡进程,这可能是其临床治疗围绝经期综合征的作用机制之一。     

香烟烟雾对卵巢颗粒细胞的影响

香烟烟雾中一些物质影响着女性卵巢功能,被育龄妇女吸收后会导致生育能力的下降甚至不育。卵泡颗粒细胞与卵泡的发育密切相关,颗粒细胞相关基因的表达可能直接影响卵母细胞的成熟及卵泡的发育,颗粒细胞的线粒体参与调节颗粒细胞的代谢、细胞周期和细胞信号转导,可能在颗粒细胞功能的发挥起到重要的作用。香烟烟雾可能通过影响线粒体功能和颗粒细胞的基因表达,从而引起雌性生殖功能的改变。     

猪卵泡闭锁过程中颗粒细胞凋亡现象的检测

目的　验证猪卵泡闭锁过程中是否存在细胞凋亡及其发生的范围。　方法　用透射电镜观察猪各类卵泡的超微结构 ,对颗粒细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析 ,对颗粒细胞涂片进行了DNA末端原位标记(TUNEL)及HE染色检测。　结果　猪的闭锁卵泡中存在大量的凋亡颗粒细胞 ,而健康卵泡中凋亡颗粒细胞则很少 ;对颗粒细胞涂片进行DNA末端标记和常规HE染色检测所得到的颗粒细胞凋亡比例分别为 :健康卵泡TUNEL法为 9% ,HE法为 3 6 % ;闭锁卵泡TUNEL法为 39 2 % ,HE法为 34 % ,尽管两种方法检测的结果之间有差异 ,但两者之间的相关系数达到 0 94。　结论　猪卵泡闭锁过程中确实存在细胞凋亡现象 ,并且凋亡细胞主要集中于颗粒层 ;同时DNA末端标记和常规HE染色检测所得到的颗粒细胞凋亡比例结果说明在某些情况下可以采用简单易行的HE法替代TUNEL法进行细胞凋亡趋势判定     

多囊卵巢综合征卵泡颗粒细胞提前对黄体生成素反应

目的： 探讨多囊卵巢综合征（PCOS）卵泡液中激素和颗粒细胞黄体生成素（LH）受体mRNA表达的关系。方法: 对PCOS组12例和对照组15例患者于月经周期的第7-10 d手术获取卵泡和卵泡液，采用微粒子化学发光法检测卵泡液中卵泡刺激素（FSH）、LH、孕酮（P）、雌二醇（E2）和胰岛素（insulin）的水平，采用ELISA检测卵泡液中雄烯二酮（A）的水平，对颗粒细胞和卵泡膜细胞LH受体mRNA进行RT-PCR半定量检测。结果: PCOS组卵泡液中LH［（3.8±2.1 vs 1.7±0.8)U/L, P<0.01］、A［(600.0±373.4 vs 212.4±205.4)μg/L, P<0.05］和颗粒细胞LH受体mRNA的表达(0.29±0.16 vs 0.12±0.13, P<0.01)显著高于对照组， PCOS组卵泡的颗粒细胞提前表达LH受体mRNA; 对照组卵泡直径小于 7 mm 时，RT-PCR检测不到颗粒细胞LH受体mRNA表达，而PCOS组卵泡直径达到 4 mm 时，发现颗粒细胞LH受体mRNA已提前表达。颗粒细胞LH受体mRNA的表达与卵泡液中LH(r=0.67,P<0.01)、胰岛素(r=0.51,P<0.05)及卵泡膜细胞LH受体mRNA表达的水平(r=0.6,P<0.01)呈正相关。结论: PCOS的卵泡液中存在高水平的LH，PCOS卵泡颗粒细胞提前对LH反应，颗粒细胞和卵泡膜细胞合成A和P增强，这可能是PCOS卵泡发育停滞的原因之一。     

LC3蛋白在小鼠卵泡颗粒细胞中的表达及定位研究

目的:探讨自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)在小鼠卵泡颗粒细胞中的表达及定位。方法:昆明小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)前及注射后的第1、2、3、4、5天,采用免疫组织化学染色方法检测自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3在卵泡中表达及共定位情况;促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)处理颗粒细胞后,Western blot检测LC3和cleaved caspase-3在颗粒细胞中的水平,免疫荧光方法对LC3在颗粒细胞中的亚细胞定位进行研究。结果:在小鼠卵泡发育的各个阶段,LC3蛋白主要在颗粒细胞中表达;免疫荧光显示在闭锁卵泡的颗粒细胞中cleaved caspase-3和LC3的蛋白水平较高;在PMSG腹腔注射后第1、2天,颗粒细胞cleaved caspase-3和LC3-II的蛋白水平减少(P0.05);在PMSG腹腔注射后第3、4、5天,颗粒细胞的cleaved caspase-3和LC3-II蛋白水平依次增加;LC3-II和cleaved caspase-3的蛋白水平具有相关性(r~2=0.8299,P0.05)。FSH处理后,LC3-II定位于颗粒细胞胞浆并呈点状分布。结论:LC3主要在卵泡颗粒细胞中表达,其表达具有细胞特异性和区域特异性,提示自噬在卵泡发育过程中主要在颗粒细胞中发生。卵巢颗粒细胞自噬和凋亡具有相关性,均呈促性腺激素依赖性。     

己烯雌酚对未成熟大鼠卵巢卵泡颗粒细胞分化的形态学观察

取出生后21～26天Sprague-Dawley未成熟雌性大鼠,分为实验与对照两组。实验组只/天注射己烯雌酚(DES)0.5mg(溶于芝麻油中),并按注射天数分为2、3、4、5天组;对照组注射等量的芝麻油。注射2天后,逐日取材固定,用光镜和电镜观察两组动物的卵巢和卵泡颗粒细胞。同时从各组卵巢中分离出卵泡颗粒细胞,用无血清McCoy 5a培养基培养,加入不同的激素,分为对照组、FSH组、DES+FSH组、FSH+hCG组。培养3天后,取材固定,用光镜、透射电镜、扫描电镜观察各组的细胞形态,结果为:1.实验组卵巢比对照组的大,卵泡也大。卵泡细胞增多,细胞体积大,分裂象多见。2.注射3天以上DES的卵巢中,闭锁卵泡和退化的卵泡细胞增多。3.电镜下,实验组卵泡细胞中与蛋白质合成有关的细胞器比对照组发达。4.体外培养的卵泡颗粒细胞,对照组细胞排列分散;FSH组细胞集聚成团,细胞表面微绒毛增多;细胞质内与合成蛋白质有关的细胞器比对照组的发达。DES+FSH组的细胞排列和结构与FSH组的相似。FSH+hCG组细胞体积增大,细胞表面微绒毛减少或消失。细胞质内出现滑面内质网,细胞开始黄体化。5.注射2～5天DES的各组细胞形态和结构均相似。从形态学来看,经DES处理的未成熟雌鼠的卵泡颗粒细胞的形态、排列和对不同激素作用下的变化,与文献报道的去垂体雌鼠的同类细胞相似。因此我们认为,未成熟雌鼠的卵泡颗粒细胞也能作为研究细胞分化的一种模型。     

白藜芦醇增加体外培养人卵泡颗粒细胞ATP的生成并促进其增殖

目的探讨白藜芦醇(Res)对体外培养的人卵泡颗粒细胞的增殖及ATP生成的影响。方法收集不孕症患者的卵泡液,进行卵泡颗粒细胞分离、培养,经纯化和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组织化学染色鉴定后体外培养。实验分为空白对照组、30μmol/L二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组、(10、20、30)μmol/L Res处理组。处理24、48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活性、增强型ATP检测试剂盒检测10μmol/L Res处理组和空白对照组24 h后的ATP生成量。结果分离培养的颗粒细胞特异性表达FSHR,阳性物质位于胞质中,阳性细胞90%以上。人卵泡颗粒细胞体外培养24~72 h,进入对数生长期。与对照组比较,(10、20、30)μmol/L Res处理24 h均可增加人卵泡颗粒细胞增殖活性。10μmol/L Res处理细胞的ATP生成量较对照组明显增加。结论 Res可以促进人卵泡颗粒细胞的增殖活性及ATP的生成。     

Smad4蛋白及mRNA在卵巢不同发育阶段的表达

目的：探讨Smad4在不同发育阶段大鼠卵巢中蛋白及mRNA的表达。 方法： 选择不同发育时期大鼠卵巢，运用免疫组化方法检测卵巢中Smad4蛋白表达，并进行图像分析；采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Smad4 mRNA在卵巢中的表达。 结果： 免疫组化结果显示Smad4主要表达在各级卵泡中，在卵巢发育早期，Smad4主要在原始卵泡和窦前卵泡中表达；随着卵巢的发育成熟，Smad4在窦状及成熟卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞的表达与间质细胞比较无显著差异（P>0.05）。Smad4在卵泡中的表达强度也发生了变化：随着卵泡的发育，Smad4在窦状及成熟卵泡卵母细胞的表达与窦前卵泡卵母细胞比较明显减弱（P<0.05，P<0.01）；在卵泡膜细胞的表达逐渐增强（P<0.01），而在各级卵泡颗粒细胞中的表达无显著差异（P>0.05）。RT-PCR结果显示各阶段卵巢均有mRNA的表达，从第3周起Smad4 mRNA的表达明显增强，与生后1 d比较差异显著（P<0.05）。 结论： 卵巢内存在Smad4，提示TGF-β家族对卵泡发育的调节很可能是通过Smad信号转导模式实现的。