骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

5-氮胞苷浓度对体外骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的影响

目的探讨不同浓度5-氮胞苷(5-aza)体外诱导小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响.方法10ml骨髓,1.077g/ml Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNCs),第2代传代细胞分别加入3,5,10μmol/L浓度5-aza化学诱导24h,与对照组连续培养4周,细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的表达,电镜观察诱导细胞的超微结构变化.结果5-aza化学诱导后MSCs形态变长、增大,排列更加紧密、整齐,5和10 μmol/L组可见较多的多核细胞,部分管状结构,诱导率分别为36%和31%,无显著性差异;3μmol/L组上述变化的细胞极少,3种浓度及对照组4周后细胞扩增数量分别为(3.81±0.40)×106、(3.76±0.62)×106、(3.67±0.80)×106及(2.90±0.21)×106,10μmol/L组增殖速度明显减慢(P＜0.05).各组诱导后的细胞均未见自发搏动.免疫组化提示desmin及cTnI表达阳性,5和10μmol/L组电镜下出现肌丝样结构、心房颗粒及细胞间的缝隙连接.结论小型猪MSCs经5、10 μmol/L 5-aza化学诱导可分化为心肌样细胞,其中5 μmol/L5-aza不仅可以诱导心肌样细胞而且对细胞增殖速度影响小.     

5-氮胞苷诱导间质干细胞为心肌细胞的实验研究

分离SD大鼠下肢骨,培养获得骨髓间质干细胞（MSCs）,经5-氮胞苷（5-aza）定向诱导24h后t用免疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白43和α横纹肌肌动蛋白的表达,用逆转录-聚合酶链反应鉴定心肌细胞特异性蛋白的表达情况。结果显示,MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;3周后5-aza 10μm组细胞连接蛋白43、α横纹肌肌动蛋白阳性表达;RT-PCR显示细胞表达心肌肌钙蛋白Ⅰ、α心肌肌动蛋白。提示5-aza可体外诱导MSCs分化为心肌细胞,用于心肌梗死的治疗。     

丹酚酸B在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程对心肌早期基因mRNA表达的影响

目的 探讨丹参单体丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Nkx2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠 MSCs 体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.方法 选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯 MSCs,并进行培养扩增.免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定.分别应用10 μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)及250 mg/L SalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24 h,于诱导后第4周,用实时荧光定量RT-PCR法检测Nkx2.5、GATA-4、Desmin和α-actin的基因表达.结果 ①第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达.②诱导4 w后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因;与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Nkx2.5、GATA-4、Desmin 和α-actin mRNA的表达明显增强.结论 SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用,并且在Nkx2.5基因表达上SalB的优势更加明显.     

不同浓度的5-氮胞苷对人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的5-氮胞苷（5-aza）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法抽取人胸骨骨髓35 ml,采用密度梯度离心法和贴壁法进行hMSCs的分离培养。于第3代生长状态良好的hMSCs中,分别加入3、5、10、20和40μmol/L 5-aza处理24 h,更换新鲜的培养基继续培养;对照组的细胞始终用完全培养基培养。光镜下动态观察细胞形态的变化,4周后用免疫组化染色法检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白43（Cx43）的表达。结果经5-aza诱导处理后,hMSCs的形态变长、增大,排列更加紧密、整齐。免疫组化染色法检测表明,对照组与3μmol/L 5-aza组cTnI、Cx43的表达呈阴性,5、10、20和40μmol/L 5-aza组cTnI和Cx43的表达均呈阳性。在一定范围内（<10μmol/L的5-aza）,随着5-aza浓度的增加,hMSCs向心肌细胞的转化率逐渐增高;但高浓度（>10μmol/L）5-aza的毒性可造成细胞大量死亡。结论hMSCs经适当浓度的5-aza处理后,可向心肌细胞分化,10μmol/L的5-aza为最适诱导浓度。     

诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

培养基血清浓度对5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响

目的 观察脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌样细胞诱导分化的适宜培养基血清浓度。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法自成人脂肪组织分离ADMSCs进行培养。对第3代细胞以10μmol／L的5-氮胞苷（5-aza）诱导作用24h,用含10％、5％胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）,计算心肌细胞转化率,采用RT—PCR方法检测NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结果5-aza诱导ADMSCs后7d细胞形态及排列开始发生变化,4周后可见极个别细胞出现细微搏动,10％、5％胎牛血清培养下心肌样细胞转化率分别为31．5％±4．2％、32．8％±5．0％,P=0．72;RT-PCR产物条带见NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结论ADMSCs在-aza诱导后于低浓度血清培养基中培养效果更好。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌细胞的观察

体外分离培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),传代纯化后取第3代接种于培养板上,分别加入5、10、20 μmol/L 5氮胞苷(5-aza),孵育12、24、48 h后,更换新鲜培养基继续培养.光镜下动态观察细胞变化,4周后免疫组化染色法检测肌钙蛋白(cTnI)、连接蛋白43(Cx43)表达.结果经5-aza诱导后,hMscs形态变长、增大,排列整齐;除对照组外,其他各组hMscs的cTnI、Cx43表达均阳性;10μmol/L 5-aza孵育24 h hMscs转化率明显增加(P<0.05).提示hMscs体外经5-aza诱导后,可向心肌细胞分化;10μmol/L 5-aza诱导24 h是最佳诱导条件.     

5-氮胞苷诱导对骨髓间充质千细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-胞苷（5-azacytidine，5-aza）对体外培养的兔骨髓问充质于细胞（mensenchymal stemcell，MSC）凋亡的影响。方法：体外分离培养兔MSC，用不同浓度5-aza诱导不同时间．观察MSC凋亡情况。结果：正常培养兔MSC有轻度细胞捌亡；5-aza诱导浓度达15μmol／L时凋亡率明显增加（P〈0．01）．当浓度达10μmol／L，诱导时间延长则细胞洲亡率明显增加（P〈0．05），超过15μmol／l。时出现成片细胞死亡。结论：5-aza诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用，其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

5-氮胞苷体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的初步研究

目的:探索不同浓度5-氮胞苷(5-aza)在不同诱导时间下对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分化为心肌细胞的诱导作用,确定最佳诱导条件。方法:体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并进行传代培养,流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34的表达,用含不同浓度5-aza(3、5、10、15、20μmol／L)培养基分别诱导12小时、24小时、48小时、72小时,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态变化;于诱导后14、28天时免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTn-I)的表达,分析细胞转化率。结果:分离培养的ADMSCs表达CD44,不表达CD34;5-aza诱导后14天时免疫细胞化学未见有心肌细胞特异性cTn- I表达,诱导28天细胞免疫细胞化学显示cTn-I表达阳性,以10μmol/L 5-aza诱导24小时为最佳体外诱导条件。结论:成人脂肪组织间充质干细胞可在体外5-aza诱导下向心肌细胞分化。     

细胞代数与5-氮胞苷浓度对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的影响

目的探讨不同细胞代数与不同5-氮胞苷(5-Aza)浓度对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向分化增殖能力的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞。选择第2代、第6代、第10代细胞,每代分为四组(三组为诱导组,一组为对照组),三个诱导组分别以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,与对照组以完全培养液连续培养5d。通过MTT法测取各代细胞诱导组与对照组第1天、第3天、第5天的OD值,计算三代细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导后及对照组的增殖率。采用免疫细胞化学法检测各代MSCs经不同浓度5-氮胞苷诱导培养4周后心肌特异蛋白cTnT、α-Actin的表达。结果正常对照组第2代与第6代细胞增殖率无统计学意义(P0.05),与第10代细胞均有统计学意义(P0.05)。相同浓度药物诱导的三代细胞,第2代细胞与第6代、第10代细胞增殖率有统计学意义(P0.05),第6代、第10代细胞增殖率无统计学意义(P0.05)。不同5-氮胞苷浓度诱导的同代细胞间增殖率无统计学意义(P0.05)。经三种浓度5-氮胞苷诱导的2代、6代、10代MSCs均表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,对照组表达为阴性。结论随着细胞代数的增加,药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的MSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin,未经诱导的MSCs不表达心肌特异蛋白。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞

目的观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.     

血管紧张素Ⅱ诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作用于人骨髓间充质干细胞（hMSCs）后,心肌特异蛋白及细胞外信号调节激酶（ERK 1/2）的表达变化。方法第8代hMSCs用0.1μmol/L AngⅡ孵育24 h。倒置显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学法标测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、间隙连接蛋白43（connexin 43）及α肌动蛋白（α-actin）表达情况,反转录PCR法检测细胞cTnI表达,透射电镜观察分化的心肌样细胞内是否有肌丝存在,W estern b lot法检测细胞ERK 1/2总蛋白表达,流式细胞仪测定心肌样细胞分化率。结果与对照组比较,AngⅡ组hMSCs诱导后细胞形态改变,第2周开始表达α-actin及connexin 43,第3周开始表达cTnI,AngⅡ组细胞ERK 1/2的蛋白表达水平逐渐增加,流式细胞仪测得心肌样细胞分化率为（23±3）%。结论AngⅡ在体外可能经ERK通路诱导hMSC向心肌样细胞分化。     

不同浓度转化生长因子β1体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的能力。方法:取SD大鼠四肢骨骨髓,密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,以TGF-β1 5μg/L(低剂量组)、10μg/L(高剂量组)对第3代BMSCs进行体外诱导,未诱导的骨髓间充质干细胞做对照。相差显微镜观察细胞形态,MTS试剂盒检测细胞活性。分化14天后,流式细胞仪分析三组细胞DNA周期;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin,c Tn I)、心肌平滑肌肌动蛋白(aactin)和心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的表达率。结果:三组细胞均呈对数生长趋势,诱导组细胞数量增长较对照组缓慢(P0.05),诱导组之间比较,细胞增长无明显差异。分析细胞DNA周期显示:诱导14天后,对照组增殖指数明显高于诱导组(P0.05),不同浓度诱导组之间比较,细胞增殖指数无明显差异。免疫荧光法检测结果显示:诱导14天后,诱导组细胞均部分表达c Tn I、α-actin及MHC,TGF-β1高剂量组细胞转化率高于低剂量组;对照组均不表达c Tn I、α-actin及MHC。结论:10μg/L TGF-β1与5μg/L TGF-β1比较,更有效促进BMSCs体外向心肌样细胞分化,且对细胞增殖活性无明显影响。     

护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨护骨素（OPG）对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的影响及可能机制。方法将HUVECs细胞分为3组：正常对照组：以0．4％牛血清白蛋白处理;软脂酸组：以0．4mmol／L软脂酸处理;OPG组：以不同浓度OPG预处理24h,再加入0．4mmol／L软脂酸（OPG浓度分别为50、100、200、400μg／L）,以上各组细胞培养24h,流式细胞术及Hoechst33258核染色检测细胞凋亡。将HUVECs细胞分为5组：正常对照组：以0．4％牛血清白蛋白处理;软脂酸组：以0．4mmol／L软脂酸处理;OPG组：以400μg／LOPG预处理24h,再加入0．4mmol／L软脂酸;软脂酸±OPG±雷帕霉素组：以10μg/L雷帕霉素预处理24h,再给予400μg／LOPG处理24h,最后加入0．4mmol／L软脂酸;软脂酸±雷帕霉素组：以10μg/L雷帕霉素预处理24h,再加入0．4mmoL／L软脂酸。以Westernblotting法分析各组HUVECs细胞马铃薯球蛋白（tuberin）、磷酸化马铃薯球蛋白（P-tuberin）、核糖体蛋白s6激酶（S6K）、磷酸化核糖体蛋白S6激酶（P-S6K）、Bcl-2、Bax以及caspase3蛋白表达水平。组间均数比较采用单因素方差分析,组问两两比较采用SNK法。结果与正常对照组比较,软脂酸组早期细胞凋亡率显著增加（18．31％±0．51％比6．88％±0．60％,P〈0．05）;OPG组早期凋亡率（12．58％±0．19％、9．39％±0．42％、7．55％±0．17％、5．90％±0．14％）明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,且呈OPG剂量依赖性;与正常对照组比较,软脂酸组晚期凋亡率显著增加（9．55％±0．22％比5．28％±0．90％,P〈0．05）;OPG组晚期凋亡率（7．71％±0．17％、6．42％±0．18％、5．24％±0．16％、4．50％±0．16％）明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,且呈OPG剂量依赖性。与正常对照组比较,软脂酸组P-tubefin／tubefin（2．0942±0．0163比1．1948±0．0541）、P-s6K／S6K（2．0942±0．0163比3．2052±0．0051）、Bax／β-actin（0．3868±0．0013比1．2991±0．0026）、caspase3／β-actin（0．2346±0．0009比0．57934-0．0103）表达水平均显著提高,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,Bcl-2／β-aetin表达显著降低（0．2470±0．0038比0．0716±0．0004,P〈0．05）;OPG组P-tuberin／tubefin（0．8258±0．0074）、P．S6K／S6K（2．5073±0．1403）、Bax／β-actin（0．7452±0．0045）、easpase3／β-actin（0．4713±0．0066）表达水平明显低于软脂酸组（均P〈0．05）,Bcl-2／β-actin（0．1909±0．0021）表达明显高于软脂酸组（P〈0．05）。结论OPG对软脂酸诱导的HUVECs凋亡具有保护作用,此作用可能通过下调tuberin／mTOR活性,增加Bcl-2表达、降低Bax及Caspase3表达实现的。     

骨髓干细胞诱导转化成心肌细胞的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞(BMCs)在5-氮杂胞苷(5-aza)的作用下是否能向心肌细胞转化。方法用梯度离心法分离大鼠BMCs;用不同浓度的5-氮胞苷对BMCs进行体外诱导转化,并使用心肌特异性抗体(肌钙蛋白I和肌凝蛋白重链)对诱导后的BMCs进行免疫组织化学染色,光镜和电镜观察。结果分离培养后的BMCs生长密集,形态呈纺锤状,在5μmol/L和10μmol/L 5-aza的诱导下分化成类心肌细胞,前者诱导后生长更好。HE染色细胞质嗜酸性,免疫组织化学染色心肌特异性抗体阳性。电镜发现胞核居细胞中央,肌丝和幼稚肌结形成。结论在5-aza的诱导下,BMCs能转化成心肌细胞,5μmol/L 5-aza的诱导效果更好。     

刺五加皂甙对PC12细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的 观察刺五加皂甙（ASS）对PC12细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响,探讨其抗缺血缺氧脑损伤作用的机制。方法将PC12细胞分为三组,对照组在无血清的DMEM培养基中培养;模型组加入终浓度为125μmol／L的CoCl2共同作用4h;ASS组先用终质量浓度为50μg／ml的ASS预处理24h,再加入终浓度为125μmol／L的CoCl2共同作用4h。采用MTT比色分析法测定各组PC12细胞活性,Western Blot法检测HIF-1α表达的变化。结果对照组、模型组、ASS组细胞活性OD值分别为0．538±0．027、0．320±0．045、0．615±0．039;HIF-1α表达灰度比值分别为0．085±0．033、0．782±0．050、0．976±0．070。各组间相比,P均〈0．01。结论ASS对缺血缺氧性脑损伤有保护作用,其机制与诱导HIF-1α表达有关。     

体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化

目的选择从人脐带血中分离出的间充质干细胞(UCB1-MSCs),通过5-氮胞苷(5-aza)进行诱导,对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨。方法培养第11代 hMSCs,加入6、9、12 μmol/L 的5-aza 分别作用24h 和48h,相差显微镜观察细胞形态直到3周后实验结束。以未经处理的细胞为对照组。采用 RT-PCR 检测心肌转录因子 MEF2C、GATA4、Nkx2.5和心肌特异性基因 MLC-2v、MLC-2a、Connexin 43及α-actinin 的表达;免疫荧光染色检测 Connexin 43和α-actinin 的表达,以共聚焦显微镜成像。结果经5-aza 诱导后观察3周未见细胞的自发搏动。诱导前后的 hMSC 均可不同程度的表达 MEF2C、Connexin 43及α-actinin。在12 μmol/L 水平诱导24h 和6、9、12 μmol/L 水平诱导48h 共4个组中可见 MLC-2a 的表达。GATA4、Nkx 2.5和 MLC-2v 在诱导前后均未见表达。免疫荧光染色显示诱导前后 hMSCs 的胞浆内存在散在排列无序的α-actinin 和 Connexin 43荧光,而始终未见肌小节结构。结论经5-aza 诱导 UCB 来源 hMSCs 在基因水平可以表达部分心肌特异性基因,但是在诱导后的一个月时间内未见相应的心肌特异性结构出现,此类细胞向心肌细胞转分化的能力需再证实。