环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用

目的建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性。该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25cfu/mL,可在60min内完成扩增反应。用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5%,与传统方法一致。结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的优势

目的 建立一种利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术快速检测副溶血性弧菌的方法.方法 采用LAMP技术扩增副溶血性弧菌,并与实时聚合酶链反应(Real-time PCR)检测法和Vitek 32自动微生物分析鉴定方法作对比.结果 LAMP技术与Real-time PCR检测法检测结果一致,12株副溶血性弧菌得到阳性扩增结果,1株创伤弧菌得到阴性扩增结果;Vitek 32自动微生物分析鉴定方法结果为12株副溶血性弧菌和1株创伤弧菌.结论 利用LAMP技术扩增副溶血性弧菌比Real-time PCR检测法和Vitek 32自动微生物分析鉴定方法有一定优势,LAMP技术为副溶血性弧菌的检测提供了新的手段.     

环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

目的基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法。方法以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌。并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较。结果 LAMP法最低检出限为10 fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值。     

CRISPR - Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立

目的 将重组酶介导的扩增（RAA）技术与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR - Cas13a）检测系统相结合,建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法（RAA - Cas13a）。方法 样本DNA经RAA扩增后,产物采用CRISPR - Cas13a检测系统进行检测,比较CRISPR - Cas13a与琼脂糖凝胶电泳对RAA产物的检测敏感性。对方法进行灵敏度与特异度测试,通过临床样本检测比较建立的方法与real - time PCR法的一致性。结果 CRISPR - Cas13a对RAA产物的检测敏感性高于琼脂糖凝胶电泳法;建立的RAA - Cas13a方法检测副溶血性弧菌的灵敏度为10拷贝DNA分子/反应,与其他病原体之间无交叉反应,与real - time PCR对临床样本的检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）,二者的检测一致性较高（kappa = 0.934）。结论 建立的RAA - Cas13a方法具有快速简单、灵敏特异等优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的工具。     

甲型流感病毒逆转录环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立了一种针对甲型流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据甲型流感病毒M基因的保守序列,利用PrimerExplorer V4软件,设计了一套针对M基因的8个区域的5条特异性引物,优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异性与灵敏性。结果该方法能检测出H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型流感病毒,而对乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检测限度为50拷贝/μl。另外,扩增反应只需要40min就能判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异性、灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行甲型流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。     

志贺菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 建立志贺菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法 针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)特征性保守序列设计1套4条引物,应用LAMP技术对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性;使用LAMP和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度;使用重组质粒计算其初始拷贝数与反应时间之间的线性关系以评估定量检测的可能性。结果 荧光定量LAMP扩增曲线图显示,LAMP技术可以在1 h内获得结果;有较好的特异性,与其他17种食源性致病菌无交叉反应;LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上,检测限达到200拷贝/μL;平均变异系数<5%;反应时间与模板初始浓度有良好的线性关系(R²=0.985 5)。结论 志贺菌环介导等温扩增检测体系是一种快速、灵敏、特异的核酸筛查方法,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

阪崎肠杆菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 针对当前国内外传统检测方法缺点,建立阪崎肠杆菌快速检测法.方法 根据阪崎肠杆菌外膜蛋白(OmpA)基因,设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立并优化环介导等温扩增(loop-mediated isotherm alamp lification,LAMP)检测体系及反应条件,并进行LAMP反应的灵敏度、特异性实验及实际样品检测.结果 LAMP检测阪崎肠杆菌,优化后的条件选择为:Mg²⁺浓度6 mmol/L,dNTP浓度0.6 mmol/L,甜菜碱浓度0.8 mol/L,外引物与内引物的浓度比1:4,扩增温度58℃60min;细菌纯培养检测灵敏度为101cfu/mL;对11种细菌共26株菌进行LAMP扩增,仅8株阪崎肠杆菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性;对实际样品进行增菌检测,采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时26 h;并采用传统检测方法验证,正确性为100%.结论 该方法检测阪岐肠杆菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低、耗时短,有望成为快速检测阪岐肠杆菌的有效方法.     

SARS冠状病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立SARS冠状病毒可视化快速检测方法。方法针对SARS冠状病毒RNA聚合酶编码基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入钙黄绿素作为LAMP扩增反应指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据钙黄绿素的颜色变化进行结果判定,评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性。结果本方法最低检出限约为10拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅SARS冠状病毒反应管钙黄绿素颜色由褐色变为黄绿色,而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,35 min内出结果。结论所建立的基于颜色判定的SARS病毒检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于SARS冠状病毒现场快速检测。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用

目的 建立一种适合基层检验部门及小型实验室使用的快速检测嗜肺军团菌的方法.方法 应用环介导等温扩增技术(LAMP),针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物(2条内引物、2条外引物及1条环引物),并对LAMP反应条件和反应体系进行优化.为验证该方法的特异性、敏感性,针对种系背景明确的12株嗜肺军团菌实验对照菌株、45株嗜肺军团菌地方分离株、6株非嗜肺军团菌、11株其他细菌以及59份外环境水样本进行检测,并将其结果与传统培养分离方法及定量PCR方法比较.结果 所检测的菌株样本中不同血清型嗜肺军团菌经LAMP检测均呈绿色为阳性,非嗜肺军团菌及其他菌株检测均呈橙色为阴性.实验结果表明,LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR.应用该方法从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右,该体系检测灵敏度为5 cfu/ml,而且其检测结果在日(灯)光下通过肉眼即可判断.结论 实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用.     

副溶血性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP）,以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。     

用PCR技术快速检测副溶血性弧菌的方法

副溶血性弧菌是引起细菌性食物中毒最常见的病原菌之一 ,为预防和早期诊断由该菌引起的食物中毒 ,建立一个快速、敏感、特异的检测方法 ,尤其是检测外环境和食品中的致病菌 ,是控制食物中毒的重要手段。在分子生物学飞速发展的今天 ,我们用聚合酶链反应 (PCR)方法对该菌进行检测。同时 ,对在 2 0 0 1年我区发生的流行病学方面怀疑是副溶血性弧菌引起的食物中毒 ,我们作PCR检测的同时进行细菌学常规培养。1　材料和方法1.1　PCR扩增仪　黑马 -4 80型基因扩增仪 ,珠海黑马医学仪器有限公司。1.2　PCR诊断试剂盒　由上海天能科技有限公司…     

副溶血性弧菌快速检测研究进展

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐性细菌,属弧菌科(Vibrio)弧菌属,主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒,在细菌性食物中毒中,比例高、危害大。目前,我国常规检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。这些实验操作繁琐,需耗时5～6d,检出率低,给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难,影响经济发展。     

霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行霍乱弧菌的快速检测。方法 针对霍乱弧菌的管家基因(mdh)设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),建立快速检测食品中霍乱弧菌的环介导等温扩增方法;应用该方法对17种细菌共42株菌进行LAMP扩增,并进行确证,全面评估该方法的灵敏度、特异性、准确性等。结果 该方法检测21株霍乱弧菌均得到阳性扩增结果,其余21株非霍乱弧菌均未扩增出条带,扩增反应最佳反应时间为60min,反应温度为65℃。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为40 fg和50 cfu/mL。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为70 cfu/g。结论 该方法具有特异性强、灵敏度高,操作简便快速、不需要复杂仪器设备,适用于食品的快速检测     

恒温扩增-核酸试纸在副溶血性弧菌快速检测中的应用

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交叉引物恒温扩增结合免疫金标方法检测副溶血性弧菌

目的用交叉引物恒温扩增技术(CPA)结合免疫金标方法快速检测副溶血性弧菌。方法用加热煮沸方法提取菌株和标本的DNA;对CPA方法进行敏感性和特异性检测,并和荧光定量PCR方法进行比较;并用建立的方法对模拟牡蛎样本进行检测。结果该方法 60℃40 min即可完成反应,且敏感性和特异性高,14株副溶血性弧菌检测结果均阳性;最低检测限为1.8 cfu/ml,模拟样本的检测限达到180 cfu/g。与荧光定量PCR检测结果一致。结论该方法具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,特别适合在基层实验室和现场快速检测。     

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。     

鼠疫耶尔森氏菌环介导等温扩增检测方法的建立

目的:将环介导等温扩增技术(LAMP)应用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。方法:针对鼠疫耶尔森氏菌F1基因设计特异性引物,进行LAMP扩增。应用LAMP技术对鼠疫菌和非鼠疫菌进行检测以确定其特异性;对倍比稀释鼠疫菌液进行检测以确定其灵敏度,并与常规PCR方法进行比较。结果:对10种非鼠疫菌进行LAMP扩增,均为阴性结果,证明该方法具有很高的特异性。LAMP方法最低检出量为20个鼠疫菌,比常规PCR方法的灵敏度高10倍。通过加入染料进行LAMP扩增可直接观察结果。结论:本方法检测鼠疫耶尔森氏菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、结果易于判定,有望发展成为快速检测鼠疫耶尔森氏菌的有效手段。     

环介导等温扩增技术研究进展

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种核酸扩增技术,该方法最大的优点是能够在63℃～65℃的等温条件下扩增特定DNA序列,并在30～60min内可以观察到结果。LAMP已经成功用于许多病毒的检测,本文主要概述与LAMP技术相关的最新发展现状,以及国外应用该技术检测食物致病菌、动物病毒、临床微生物等方面进展。LAMP作为一种快速、简便、灵敏、特异,无需贵重检测设备而易普及的检测技术,在一些基层实验室、流行病学调查和检验检疫等领域具有广阔的应用前景。