腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

Hyper-IL-6重组腺病毒的制备

目的 探讨大量制备高滴度重组腺病毒的方法 .方法 以Pac-1酶切Hyper-IL-6重组腺病毒(AdHIL-6)质粒,乙醇沉淀回收DNA,将线性化的AdHIL-6质粒经脂质体转染293细胞进行病毒的包装扩增,以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,根据GFP(绿色荧光蛋白)计数法和有限稀释法原理测定病毒滴度及感染293细胞、L02细胞的MOI(Multiplicity of infection,感染复数),并以免疫细胞化学检测感染L02细胞后目的 蛋白Hyper-lL-6的表达.结果 收集的病毒液经PCIL扩增出目的 条带,测得病毒滴度为1.6×109pfu/mL,AdHIL-6感染293细胞、L02细胞的MO1分别是7和54,感染L02细胞后Hyper-IL-6强阳性表达.结论 成功地完成了Hyper-IL-6重组腺病毒的制备,为后续的腺病毒载体介导的基因治疗奠定了基础.     

编码绿色荧光蛋白和βARKct的重组腺病毒的制备

[目的]制备编码绿色荧光蛋白(GFP)和Gβγ活性抑制剂βARKct的重组腺病毒载体.[方法]构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-βARKct,经PmeI线性化后转化入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-I的BJ5183菌,筛选获得重组腺病毒质粒pAdEasy-gfp-βARKct.用LipoFectamine 2000将经PacI线性化的pAdEasy-gfp-βARKct转染入人胚肾293细胞,包装并扩增出重组腺病毒颗粒rAd-gfp-βARKct.用氯化铯高速梯度离心、纯化rAd-gfp-βARKct.用rAd-GFP-βARKct干预去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大过程,观察对β肌球蛋白重链(βMHC)基因表达的影响.[结果]将pAdTrack-CMV-βARKct转入含pAdEasy-I的BJ5183菌后获得20%的阳性重组体克隆.重组腺病毒质粒在293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有βARKct编码基因.透析纯化得到重组腺病毒滴度为6.0×106 pfu/mL.rAd-GFP-βARKct表达的βARKct可抑制乳鼠心肌细胞βMHC的高表达.[结论]成功构建重组腺病毒载体,并在293细胞中包装、制备出可表达βARKct的重组腺病毒rAd-gfp-βARKct.     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体的构建及表达

目的 制备人血小板源性生长因子-A(human platelet-derived growth factor A, hPDGF-A) 和人β防御素2(human beta defensins, hBD2)双基因共表达腺病毒载体并观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)中的表达.方法 将hPDGF-A和hBD2通过内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site, IRES) 连接后,以同源重组的形式插入腺病毒表达载体,由人胚肾293 细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒.重组病毒感染BMSCs后,用RT-PCR检测重组腺病毒的表达.结果 ①成功构建穿梭质粒pAdTrack-hPDGF-A-IRES2-hBD2.②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-hPDGF-A-IRES2-hBD2.③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒.④转染的BMSCs高表达hPDGF-A和hBD2.结论 构建了hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体,证实其转染BMSC后的表达.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

用RNA干扰腺病毒载体研究Wnt/β-连环蛋白信号途径对人甲状腺细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,从转录后水平抑制GSK-3β基因表达,探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人甲状腺细胞增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建短发夹RNA(shRNA)腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度;RNAi腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞,Western印迹法检测其对GSK-3β蛋白表达的抑制效应;利用构建的RNAi腺病毒抑制GSK-3β表达,BrdU法检测原代培养人甲状腺细胞增殖活性.结果 成功构建了GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞后,GSK-3β蛋白的表达受到明显抑制,β-catenin蛋白表达显著增加(1.324±0.057 vs 0.935±0.029,P<0.05);腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞1、3、5、7 d后,RNAi腺病毒组比空病毒组细胞增殖率明显增加(1.473±0.035 vs 1.312±0.043、1.226±0.045 vs 0.959±0.066、0.776±0.041 vs 0.605±0.054、0.337±0.018 vs 0.259±0.021,P<0.05).结论 构建的目的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制GSK-3β基因的表达;Wnt/β-catenin信号通路在人甲状腺细胞的增殖中有重要影响.     

β-catenin腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人β-catenin基因的重组腺病毒载体,为进一步研究Wnt/Wingless信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制奠定重要基础.方法:以含有β-catenin的pcmv-βNS-FC质粒为模板PCR获得目的基因,将目的基因定向克隆至腺病毒穿梭质粒构建阳性重组pAd track-β-catenin,并经PmeI线性化后在BJ5183细菌中与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组获得β-catenin重组腺病毒载体,再将PacI线性化的腺病毒质粒转染HEK293细胞包装重组腺病毒.结果:PCR及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒质粒中,目的基因序列与GENEBANK报道一致,荧光显微镜可观察到GFP的表达.结论:成功构建pAd-β-catenin腺病毒质粒载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒.     

腺病毒介导的干扰素-β基因对SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的:观察腺病毒介导的干扰素-β(IFN-β)基因能否诱导人肝癌SMMC-7721细胞体外凋亡.方法:用HEK293A细胞扩增重组腺病毒介导的人干扰素-β(AdhlFN-β)基因,经纯化后用空斑形成实验法测定病毒滴度;分别用AdhIFN-β基因和重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白(AdGFP)基因转染人肝癌SMMC-7721细胞.并设空白对照组.应用免疫细胞化学方法检测hIFN-β基因的表达,应用Hochest 33342荧光染色法和流式细胞术检测转染重组AdhIFN-β基因组、空载体组和对照组细胞的凋亡情况.结果:重组腺病毒经HEK293A细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011 pfu/mL,且40 MOI的腺病毒即可获得95%以上的转染效率;免疫细胞化学法检测到外源性hIFN-β基因在SMMC-7721细胞中的蛋白表达产物;荧光染色法检测到重组AdhIFN-β基因组细胞明显发生了凋亡,而重组AdGFP组和空白对照组细胞凋亡不明显;流式细胞术检测到转染重组AdhIFN-β基因组细胞凋亡率[(28.27±4.21)%]高于转染空载体组[(2.08±0.89)%]和对照组[(1.53 4±0.70)%](F=377.625,P<0.001),后2组细胞凋亡率比较差异无统计学意义.结论:腺病毒介导的hIFN-β基因能诱导体外肝癌细胞发生凋亡.     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

大鼠SOCS3腺病毒的构建及鉴定

目的:构建大鼠细胞因子信号途径抑制物3(SOCS3)腺病毒载体,并对腺病毒感染后的HEK293细胞的SOCS3表达情况进行观察。方法:提取大鼠腹腔巨噬细胞中总RNA,克隆出SOCS3基因,亚克隆于含有GFP报告基因的穿梭质粒pAdtrack-CMV,通过pAdeasy-1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭质粒和骨架质粒共转入BJ5183感受态细胞。线性化重组的病毒转染入HEK293细胞,并在其中对重组的腺病毒进行包装及扩增。结果:构建的大鼠SOCS3腺病毒能够高效率的感染HEK293细胞,mRNA和蛋白水平均证实SOCS3表达显著增加。结论:大鼠SOCS3腺病毒载体构建成功,可用于体内转染或细胞试验的进一步研究。     

小鼠PPA1重组腺病毒的构建及在胰岛β细胞中的表达

目的:构建小鼠PPA1重组腺病毒,观察重组腺病毒在小鼠胰岛和β－TC6细胞中的表达,以及对脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡的影响?方法:将目的基因PPA1插入到腺病毒穿梭质粒pAdtrack－CMV中,质粒经PCR鉴定正确后用PmeⅠ酶切线性化,转到含有腺病毒骨架pAdeasy－1的 BJ5183细菌中进行同源重组,重组成功的质粒经PacⅠ酶切线性化后转染QBI－293A细胞,经包装得到Ad－PPA1腺病毒?根据绿色荧光蛋白(GFP)检测病毒滴度和感染效率?用病毒感染小鼠胰岛和β－TC6细胞,以Western blot法检测PPA1蛋白表达水平?Hoechst染色法检测PPA1对细胞凋亡的影响?结果:重组腺病毒载体pAdeasy－PPA1经酶切鉴定确认构建成功,将pAdeasy－PPA1转染QBI－293A细胞,观察细胞病变效应提示病毒成功包装?重组腺病毒能够有效感染小鼠胰岛和β－TC6细胞并成功过表达 PPA1蛋白?Hoechst染色结果表明过表达PPA1可保护脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡?结论:成功构建携带小鼠PPA1基因的重组腺病毒,并证实过表达PPA1具有抗凋亡的作用,为进一步研究PPA1在胰岛β细胞中的功能奠定了基础?     

IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的利用细菌内同源重组法构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的!-干扰素诱导蛋白10(IP-10)重组腺病毒载体并制备重组腺病毒。方法将IP-10编码序列克隆入带有EGFP示踪的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-CMV/IP-10,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd/IP-10;酶切鉴定正确后转染HEK293细胞。收集病毒上清,PCR鉴定正确后,扩增并再次感染HEK293细胞检测病毒感染能力。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在HEK293细胞中包装成有感染活性的病毒颗粒。结论成功地构建了表达IP-10蛋白的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒Ad/IP-10,为研究IP-10的蛋白功能提供了一个重要工具。     

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP的构建及其对UT-7/Epo细胞感染效率的检测

目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制。方法先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达。结果成功制备了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2%,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7%。感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制。