Sonic Hedgehog信号通路在大鼠牙髓炎中的作用

目的:观察Sonic Hedgehog(Shh)信号分子在大鼠牙髓炎中的免疫定位,探讨Shh信号通路在牙髓防御和修复中所起的作用。方法:将15只SD大鼠随机分成1d、3d和7d组,每组5只,用穿髓开放法建立大鼠牙髓炎模型,3组大鼠分别于术后1,3,7d处死,取出下颌磨牙,常规组织学处理,免疫组化方法检测Shh,Smo,Ptc,Gli1的表达,并对Shh信号通路在大鼠牙髓炎中的表达进行半定量分析,对照组为大鼠正常牙髓。结果:大鼠牙髓炎模型1,3,7dShh广泛表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞及远离穿髓孔的根髓细胞中,表达量随炎症的进展无显著性提高(P>0.05)。Ptc、Smo、Gli1在大鼠牙髓损伤后1d未见阳性表达,3d和7d均表达于穿髓孔下方牙髓间充质细胞中,且表达量均有显著性提高(P<0.05)。空白对照组中Shh信号通路阴性表达。结论:Shh信号通路在牙髓炎过程中表达,提示其可能被激活,参与牙髓炎症反应。     

初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞Hedgehog信号通路影响

目的:探究右归丸治疗骨质疏松症的疗效机制是否与激活Hedgehog信号通路,促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化有关,从而为右归丸预防治疗骨质疏松提供依据。方法:体外分离培养大鼠BMSCs,将SPF级大鼠随机分为4组,正常组、诱导液组、福善美组、右归丸组,对大鼠进行灌胃5 d。制备含药血清,并观察上述4组含药血清对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞中的音猬因子(Ssonic hedgehog,Shh)、12次跨膜蛋白(Ptched,Ptc)、Gli家族锌指蛋白-1(Gli family zinc finger-1,Gli-1)。结果:与正常组和阳性药物组及诱导液组相比,右归丸组的蛋白表达水平明显上升。结论:①Hedgehog信号通路的Shh、Ptc、Gli1的变化可能引起骨质疏松症;②右归丸可以诱导BMSCs内Shh、Ptc、Gli1蛋白的表达;③右归丸能够有效治疗骨质疏松,这种作用可能通过Hedgehog信号通路来实现。     

sonic hedgehog信号通路在血管平滑肌细胞中的表达及意义

目的 研究sonic hedgehog(Shh)信号通路各蛋白在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达情况,探讨其是否与VSMC的增殖相关.方法 应用免疫荧光、激光共聚焦检测Shh信号通路蛋白在体外培养的VSMC中的表达,MTT法及Ki67的表达情况联合评价细胞增殖.结果 Shh信号通路的配体Shh蛋白、patched1受体及其下游转录因子Gli2在VSMC中有表达,MTT法及Ki67染色结果显示外源的Shh蛋白能够促进VSMC的增殖,而应用Shh信号通路的特异抑制剂Cyclopamine则能抑制细胞增殖.结论 Shh信号通路与VSMC增殖密切相关.     

白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活

目的 研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs.MSCs分为3组,白藜芦醇诱导组:用含白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;对照组:用无血清DMEM/F12诱导MSCs分化;正常组:不做诱导处理.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法、免疫印迹法检测NSE、MAP-2、GFAP、Smo和Gli1蛋白的表达和移位.结果 白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元.免疫荧光显示正常组及对照组MSCs轻度表达神经元NSE蛋白,白藜芦醇诱导组MSCs NSE、MAP-2阳性,但诱导前后细胞始终未表达胶质细胞GFAP蛋白.免疫荧光显示,MSCs具有初级纤毛,并表达Smo和Gli1.白藜芦醇诱导组Smo从细胞质进入初级纤毛,Glil从细胞质进入细胞核,同时,Smo、Glil蛋白的表达增加(P＜0.01).对照组则无明显变化.结论 白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞;此过程中Shh信号通路被激活,推测Shh信号在MSCs分化过程中可能发挥着重要作用.     

Nogo-A/B蛋白在RCS大鼠视网膜色素变性过程中的表达

目的 观察髓磷脂抑制蛋白Nogo-A/B在遗传性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)遗传模型皇家外科学院大鼠( Royal college of surgeons rat,RCS)视网膜变性发展过程中的表达并探讨其意义.方法 按出生后视网膜变性的发展程度将RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)分为P15d、P30d、P60d和P90d 4组,采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照,5只/时间点,利用免疫组织化学技术及免疫印迹检测2组(共40只)RCS视网膜上Nogo-A/B蛋白的表达趋势.结果 与对照组相比,①P15d、P30d RCS-p+大鼠视网膜各层结构和细胞数目无明显变化,仅节细胞数目轻微减少；P60d、P90d大鼠视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)和内核层(inner nuclear layer,INL)结构出现明显紊乱,细胞数目的减少以ONL和神经节细胞层(ganglion cell layer,RGC)层为主.②IH显示Nogo-A/B蛋白在RCS-p+大鼠各时间段视网膜表达均为阳性,P15d开始出现,随变性过程呈升高趋势,主要表达在INL和RGC层,阳性细胞数目显著高于对照组.③WB免疫印迹检测结果显示P15d、P30d、P60d和P90d Nogo-A蛋白表达量分别为(0.82737±0.212 92)、(1.110 19±0.089 99)、(1.315 52±0.028 57)、(1.268 81±0.080 42),与对照组相比有显著差异(P＜0.05).Nogo-B2蛋白与Nogo-A蛋白表达趋势一致,但总体表达量较低.结论 Nogo-A蛋白可能参与了视网膜色素变性过程中视神经损伤后的再生修复抑制.     

干预Hedgehog信号对肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:探讨Hedgehog(HH)信号通路的活化和抑制对肾小管上皮细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为对照组、活化组(10μg/L Shh)和干预组(10μg/L Shh加5μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测HH信号关键分子Ptch1、Smo和Gli1,以及细胞增殖标志物PCNA的表达,real-time RT-PCR检测Ptch1和Smo m RNA的表达。结果:免疫荧光染色显示,对照组细胞维持一定的增殖状态,HH信号活性较低,PCNA表达水平较低;当外源性重组蛋白Shh活化NRK-52E细胞24 h后,Smo和Gli1 m RNA和蛋白表达显著升高,Ptch1的表达显著下调,这提示Shh可激活HH信号(P<0.05)。在此过程中,PCNA表达水平显著升高,NRK-52E细胞数量增加,同时伴随细胞形态的改变;在Shh的基础上加入环杷明干预后,HH信号被抑制(P<0.05),PCNA表达下降,NRK-52E细胞增殖被抑制,出现凋亡或坏死。结论:HH信号与肾小管上皮细胞的增殖密切相关。通过药物调控HH信号的活化,可影响PCNA的表达,进而影响细胞增殖效应。     

枸杞子提取液对RCS大鼠遗传性视网膜变性的作用

目的 观察枸杞子提取液(LBA)对RCS大鼠遗传性视网膜变性的治疗作用.方法 出生后RCS大鼠24只,随机分为对照组和治疗组,每组12只.治疗组RCS大鼠出生后10 d开始喂食1 mg/kg的LBA, 对照组正常饲养.两组大鼠分别在出生后25、35、45 d取眼球,制备组织切片,应用苏木精-伊红(HE)染色和TUNEL染色观察视网膜感光细胞坏死和凋亡情况,并应用免疫组化方法检测Caspase-2的表达.结果 治疗组大鼠出生后25 d 和35 d时TUNEL染色阳性细胞与对照组相比明显减少(t=3.33～6.72,P<0.05);治疗组和对照组大鼠生后25～45 d时Caspase-2在节细胞层和内核层均有表达,但在25 d时治疗组与对照组相比明显减少(t=6.33,P<0.05).结论 在RCS大鼠遗传性视网膜变性的早期,LBA通过抑制细胞凋亡及Caspase-2表达对神经元起保护作用.     

RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.     

RCS大鼠病变过程中视网膜电图振荡电位的频域特性分析

目的 观察皇家外科学院大鼠(royal college of surgeons,RCS)视网膜变性过程中的暗适应视网膜电图(electroretinogram,ERG)振荡电位(oscillatory potentials,OPs)频域特性.方法 选择出生后20、30、40 d及60 d的RCS大鼠各3只,采用RETI-sean记录系统进行闪光视网膜电图(flash electroretinogram,F-ERG)OPs记录,记录电极为环形角膜电极,参考电极为不锈钢针状电极,刺激强度为0dB,通过Matlab提取OPs成分,分析其频谱特性.结果 相对于同龄的正常大鼠,RCS大鼠OPs频域幅值明显重度降低(P＜0.01),且高频成分缺失.RCS大鼠发育过程中,随着病程进展至40 d时对应的频率向高频部分明显延迟(P＜0.05),进展至60d时其频域幅值明显降低(P＜0.05).结论 RCS大鼠ERG的OPs频域特性与视网膜功能的变性程度存在相关性,利用这些特性可以更明显观察到视网膜变性对大鼠视网膜功能的影响.     

RCS大鼠视网膜色素变性过程中内源性干细胞激活的初步研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeon's rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中是否有内源性视网膜干细胞(retinal stem cells,RSCs)激活.方法RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS 15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS 90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C15 d,C30 d,C90 d),每组4只8眼,对各组视网膜切片进行免疫荧光组织化学(抗Chx10)实验,以鉴定视网膜干细胞;进一步采用Western blot检测各组视网膜神经上皮总蛋白中Chx10表达.结果①各正常组及变性15 d大鼠视网膜各层抗Chx10免疫荧光检测均为阴性,变性中、晚期视网膜光感受细胞层部位Chx10免疫荧光阳性;②Western blot检测各变性组视网膜神经上皮总蛋白中Chx1O均有表达,但变性中期Chx10表达显著高于早期和晚期(P＜0.05).结论 RCS大鼠变性过程中视网膜感光细胞层出现视网膜干细胞激活.     

N-Arg对RCS大鼠遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响

目的:研究一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂对遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响.方法:测定出生后不同鼠龄RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜的诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)活性;出生后第17天RCS大鼠玻璃体腔内注射NOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸(Nω-nitro-L-arginine,N-Arg),并于出生后第22、27和32天重复注射,于出生后第38天以TUNEL法检测视网膜视细胞凋亡.结果:RCS大鼠出生后第25天,视网膜iNOS活性达高峰;注射N-Arg后,视网膜TUNEL阳性视细胞核相对面积显著降低,外核层明显增厚,杆锥层显著变薄.结论:一氧化氮合酶抑制剂对遗传性视网膜变性具有潜在的临床治疗价值.     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白表达的关系

①目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。②方法 对：RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。③结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚，视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降，到出生后60d，仅少许感光细胞存留。出生后25～40d，RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL，染色阳性的感光细胞，阳性细胞数35d最多。30～40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达，35d时内核层阳性表达细胞数最多，外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达。④结论 RCS大鼠视网膜变性过程中，感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白的表达

目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。方法 对RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚,视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降,到出生后60d,仅少许感光细胞存留。出生后25～40d,RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL染色阳性的感光细胞,阳性细胞数35d最多。30-40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达细胞,35d时内核层阳性表达细胞数最多。外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达细胞。结论 RCS大鼠视网膜变性过程中。感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

金纳多对RCS鼠视网膜色素变性神经元保护作用

目的 探讨金纳多（Ginaton，EGb761）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元保护作用的机制。方法 将出生后雄性RCS大鼠48只随机分为给药组和对照组。给药组大鼠从生后7d开始腹腔注射金纳多，每3d注射一次，剂量为100mg／kg。对照组大鼠注射生理盐水，剂量相同。苏木精-伊红染色和TUNEL检测观察EGB761对视网膜色素变性神经元的保护作用。应用免疫组织化学方法检测Caspase-2蛋白的表达。结果 给药组大鼠生后20和25d，感光细胞的数目与对照组大鼠比较明显增加（t=3．32、3．56，P〈0．05）。给药组大鼠生后25d TUNEL检测阳性细胞数目比对照组少，差异有统计学意义（t=3．74，P〈0．05）。生后25～40d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和内核层观察到Caspase-2阳性染色。给药组大鼠生后20和25d时内核层Caspase-2阳性细胞数少于对照组（t=2．87，P〈0．05）。结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期，EGb761对神经元起保护作用，其作用机制可能与Caspase-2蛋白的低表达有关。     

RCS大鼠视网膜变性过程中α亚型神经节细胞树突形态学变化

目的研究皇家外科学院大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)视网膜变性过程中α亚型视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)树突形态学变化规律。方法按照视网膜色素变性发展的不同阶段,选取出生后21、30、60、90d的RCS-P+大鼠(RCS组)与RCS-rdy+大鼠(对照组)各3只,采用DiI示踪标记方法观察RCS组α亚型视网膜神经节细胞的树突在视网膜变性过程中形态学变化的规律。结果RCS组各天龄间、对照组大鼠发育过程中各天龄间、RCS组与对照组相对应天龄段间一、二级分支数目之间比较无显著差异(P0.05)。RCS组大鼠视网膜变性过程中,α亚型RGCs树突一级分支直径60d组较21d组变细[(2.02±0.17)μmvs(2.66±0.11)μm,P0.01],RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突一级分支直径比较,21d增粗[(2.66±0.11)μmvs(2.23±0.10)μm,P0.01]。RCS组90d(15.44±1.50)较21d(26.91±3.01)、30d(27.20±1.99)α亚型RGCs细胞树突分支频率显著减少(P0.01,P0.05)。对照组大鼠发育过程中α亚型RGCs树突分支频率比较,60d(28.67±2.78)较21d(16.09±1.71)、30d(17.75±1.79),90d(26.18±2.48)较21d组有显著增加(P0.01,P0.05),其余各组间没有明显差异(P0.05)。RCS组与对照组大鼠α亚型RGCs树突分支频率相对应21、30、60、90d组间比较均有显著差异(P0.05)。结论RCS大鼠视网膜色素变性过程中,视网膜α亚型RGCs树突分支频率在早期增多,但随着病变的发展到中、晚期树突终末分支显著减少,提示在视网膜变性过程中α亚型RGCs树突的信息传递功能可能发生了变化。     

枸杞子提取液对RCS大鼠视网膜色素变性的保护作用

目的 观察枸杞子提取液(LBA)对RCS大鼠视网膜色素变性的治疗作用.方法 RCS大鼠24只,随机分为给药组和对照组,各12只.给药组大鼠出生后10 d开始喂食LBA(1 mg/kg), 对照组大鼠喂食等量生理盐水.两组大鼠分别于生后25、35、45 d处死,取出眼球,制备组织切片,苏木精-伊红染色和TUNEL法检测视网膜感光细胞的数量.结果 与对照组比较,给药组大鼠出生25 d时感光细胞数目增多,TUNEL阳性细胞数目减少,差异有统计学意义(t=3.12、3.41,P<0.05).结论 在RCS大鼠视网膜变性的早期应用LBA,可对早期变性的神经元发挥保护作用.     

白藜芦醇对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜组织中Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的：研究白藜芦醇对大鼠视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）后视网膜组织中Caspase-3和Bcl-2表达的影响,探讨白藜芦醇对RIRI的治疗作用及其机制。方法：选取SD大鼠90只,随机分为假手术组、模型组和治疗组,每组30只,通过对前房加压建立大鼠RIRI模型,模型组和治疗组大鼠缺血再灌注1、6、12、24和48 h,治疗组大鼠用微量注射器于大鼠玻璃体腔内注射0.5 nmol·L^-1的白藜芦醇5 μL。采用倒置显微镜观察视网膜组织结构,采用免疫组织化学法和Western blotting法检测各组大鼠视网膜组织中Caspase-3和Bcl-2的阳性细胞数和蛋白表达水平。结果：模型组大鼠造模后视网膜组织水肿,可见神经节细胞空泡样变性,细胞层排列呈现疏松状,视网膜神经节细胞数目大量减少,边界模糊,神经纤维层明显变薄;治疗组大鼠视网膜组织结构、损伤程度及神经节细胞变性程度均轻于模型组。免疫组织化学检测,与模型组比较,治疗组大鼠视网膜组织中Caspase-3和Bcl-2阳性细胞数明显升高（P<0.05）。Western blotting法检测,与模型组比较,治疗组大鼠各时间点视网膜组织中Bcl-2蛋白表达水平升高,24和48 h时差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组各时间点大鼠视网膜组织中Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。结论：白藜芦醇对RIRI大鼠的视网膜神经节细胞结构有改善作用,其作用机制可能与降低视网膜组织中Caspase-3表达水平及升高视网膜组织中Bcl-2表达水平有关。