ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达

目的:构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA,并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.方法:设计合成3对pkv2基因shRNA序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGcsi空载体,构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒:采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列:脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选,获得比较单一的转染细胞;分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误:绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功:RT-PCR和Western blot均表明,与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比,转染重组表达质pGCsi-Pyk2 shRNA细胞t'Pyk2mRNA及蛋白表达水平均明显降低.结论:成功构建重组质pGCsi-Pyk2 shRNA.并证明他能降4Pyk2在Lovo胞株系中的表达,为进一步研究Pyk2何调控Hic-5/ARA55,Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.     

靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的: 构建靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用.方法: 设计合成靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与pSUPER载体连接, 构建VEGF siRNA表达载体, 经酶切鉴定和测序确认后, 脂质体2000介导VEGF siRNA转染HepG2细胞. RT-PCR及Western blot检测VEGFsiRNA表达载体转染的HepG2细胞中VEGF基因表达.结果: 通过双酶切鉴定和测序分析, 成功构建了靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体. RT-PCR和Western blot法检测转染VEGFsiRNA表达载体的HepG2细胞VEGF mRNA及VEGF165表达下调, 其抑制率分别为65%和74%. 实验组中的HepG2中VEGF mRNA表达较阴性对照组、空载体组表达量显著下降(0.304±0.062 vs 0.896±0.061, 0.884±0.074,P<0.05).结论: 成功构建了靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体, 且该载体在体外能有效抑制HepG2细胞VEGF基因表达.     

pCMV-HSF2-FLAG重组质粒的构建及其在Caco-2细胞中的表达

目的:构建人HSF2 pCMV-Myc真核表达载体,研究其在人结肠上皮肿瘤细胞Caco-2内的表达和定位.方法:以HSF2 Human cDNA ORF clone为模板,PCR法扩增出全长HSF2编码系列,用EcoRⅠ和KpnⅠ对HSF2 PCR纯化产物双酶切后,采用基因重组技术将其插入至pCMV-Myc载体中.DNA测序正确后,脂质体法将重组质粒转染到Caco-2细胞内,提取细胞总RNA逆转录为cDNA后进行普通PCR检测HSF2 mRNA转录水平,提取细胞蛋白进行Western blot检测HSF2蛋白质水平及融合蛋白表达.采用激光共聚焦显微镜观察HSF2及融合蛋白在Caco-2内的表达和定位.结果:将人全长HSF2编码序列克隆到真核表达载体pCMV-Myc中,酶切鉴定片段为1557bp,重组质粒测序正确.转染重组质粒后,PCR显示HSF2在mRNA水平较未转染组和空载组升高;Western blot检测到融合蛋白正确表达,分子量约为70kDa.与未转染组和空载组相比,重组质粒组HSF2蛋白质水平明显升高.激光共聚焦显微镜下观察到HSF2和融合蛋白定位一致,主要分布于Caco-2细胞质中,少量聚集在细胞核膜.结论:成功构建了人全长HSF2编码序列的pCMV-HSF2-FLAG真核表达载体,并在Caco-2细胞中成功表达,为进一步研究HS F2在溃疡性结肠炎中的作用奠定了良好的基础.     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

人工合成肺孢子菌p55抗原串联基因真核表达载体的构建及表达

目的 研究肺孢子菌p55抗原人工合成串联基因的真核表达载体构建及其表达鉴定。方法 从肺孢子菌p55蛋白5个变异体中选取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位,串联合成一段多表位基因,命名为TAG。将TAG双酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表达载体,构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,将重组质粒转染至感受态TG-1大肠杆菌中进行扩增后,经提取纯化质粒再转染至HEK293细胞,用Western blot鉴定蛋白表达水平。结果 构建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒经酶切后测序鉴定,证明其序列正确,成功转染至HEK293细胞,Western blot检测其在HKE293细胞中能进行有效基因表达。结论 本研究构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步阐明TAG的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究奠定基础。     

pEGFP-C1-PTEN的构建及其在乳腺癌细胞ZR-75-1中的表达

采用分子克隆技术构建重组质粒人野生型PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-PTEN),以脂质体转染法转染人乳腺癌细胞株ZR-75-1中,应用RT-PCR、Western印迹法分析目的 基因的表达.双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约1.2 kb,测序法进一步证实该基因为PTEN编码基因,经NCBIBLAST分析与Gene Bank中基因序列完全相同;RT-PCR、Western印迹显示pEGFP-C1-PTEN转染组有PTENmRNA及PTEN蛋白表达.成功构建了人野生型PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-PTEN,并将其成功转染入乳腺癌细胞ZR-75-1中,为研究PTEN在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的人硫酸酯酶修饰因子2（SUMF2）真核表达载体。方法用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,HBEC）获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符。酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的片段。经测序鉴定,序列与GenBank（NM₀15411.2）中的序列高度同源。荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达。Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础。     

VEGF-C基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和表达

目的:利用质粒pSilencer3.1-H_1构建针对人血管内皮生长因子-C(VEGF-c)基因的表达载体,测序鉴定并观察在胃癌细胞中的表达.方法:根据质粒pSilencer3.1-H_1要求设计两对小干扰RNA靶序列,退火形成互补的双链,通过与线性化的pSilencer3.0-H_1相应位点连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,酶切电泳及测序鉴定后转染胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检测转染前后VEGF-C基因的蛋白表达.结果:经酶切和测序鉴定,针对VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功.转染胃癌细胞株SGC-7901后,Western blot检测显示VEGF-C基因蛋白表达明显降低,pSilencer3.1-VEGF-C1组抑制效果明显,其抑制率为81.2%,与阴性对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:成功构建了针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体和稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901.     

Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定

目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Western blot检测FADD的表达水平.结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.结论: 成功构建真核表达载体pEGF P-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.     

TRAIL真核表达质粒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的 构建TRAIL真核表达质粒并初步研究其在膀胱癌细胞中的表达.方法 提取Jurkat淋巴瘤细胞总RNA,进行RT-PCR反应,产物测序证实后插入经同样酶切的质粒PcDNA3.1中,构建成真核表达质粒PcD-NA3.1-TRAIL.Western blot法鉴定其能否在膀胱癌细胞中表达.结果 Jurkat淋巴瘤细胞的RT-PCR产物经测序证实为TRAIL基因的全长序列;经酶切、测序证实成功构建PcDNA3.1-TRIAL质粒;Western blot结果显示,转染上述质粒的膀胱癌细胞中有TRAIL的表达.结论 成功构建了表达全长TRAIL的真核表达载体,并通过Westernblot验证其可在膀胱癌细胞中表达.     

弓形虫二氢叶酸还原酶一胸背酸合成酶ROP17真核表达载体的构建及ROP17参与自噬的研究北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫二氢叶酸还原酶一胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFR-TS)-棒状体蛋白17真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,将其转染人胚肾细胞(HEK 293T)后观察ROP17对细胞自噬的作用。方法以弓形虫速殖子总RNA为模板.逆转录PCR(RT-PCR)扩增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表达载体pIRES的多克隆位点B,构建重组质粒pIRES/TgDHFR-TS.经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后.用脂质体法转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot检测DHFR-TS的表达。以弓形虫速殖子ecDNA为模板,PCR获得ROP17.将其引人重组质粒pIRES/TgDHFR TS的多克隆位点A.构建重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17。重组载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后转染人胚肾细胞(HEK 293T),对转染细胞血清饥饿诱导,通过.Western blot检测自噬标志蛋白LC3-II、Beclin-1和P62的表达。结果RT-PCR检测显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1809 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序显示工具载体pIRES/TgDHFR-TS构建成功;转染293T细胞后RT-PCR和Western blot转染pIRES/TgDHFR TS的细胞中有TgDHFR TS的表达,基因大小为1809 bp.蛋白相对分子质量约为68X103。菌液PCR、双酶切和测序显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17构建成功,转染293T细胞后RT-PCR和Western blot检测转染pIRES/TgDHFR TS TgROP17的细胞中有TgROP17的表达.基因大小及蛋白分子质量与预期相符,而转染pIRES/TgDHFR-TS质粒组未见相应基因及蛋白表达。经血清饥饿诱导后,Western blot.检测显示随着去血清时间的延长,LC3-I向LC3-II的转化、Beelin-1蛋白逐渐增加、P62蛋白逐渐减少。结论成功构建了工具载体pIRES/TgDHFR-TS和重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,且能在真核细胞中表达,表达的弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)能促进血清饥饿诱导的细胞自噬。     

人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶-ROP17真核表达载体的构建及ROP17参与自噬的研究

目的构建刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFRTS)-棒状体蛋白17真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,将其转染人胚肾细胞(HEK 293T)后观察ROP17对细胞自噬的作用。方法以弓形虫速殖子总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表达载体pIRES的多克隆位点B,构建重组质粒pIRES/TgDHFR-TS。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot检测DHFR-TS的表达。以弓形虫速殖子cDNA为模板,PCR获得ROP17,将其引入重组质粒pIRES/TgDHFR-TS的多克隆位点A,构建重组载体pIRES/TgDHFR-TSTgROP17。重组载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后转染人胚肾细胞(HEK 293T),对转染细胞血清饥饿诱导,通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达。结果 RT-PCR检测显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 809bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序显示工具载体pIRES/TgDHFR-TS构建成功;转染293T细胞后RT-PCR和Western blot转染pIRES/TgDHFR-TS的细胞中有TgDHFR-TS的表达,基因大小为1 809bp,蛋白相对分子质量约为68×10~3。菌液PCR、双酶切和测序显示重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17构建成功,转染293T细胞后RT-PCR和Western blot检测转染pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的细胞中有TgROP17的表达,基因大小及蛋白分子质量与预期相符,而转染pIRES/TgDHFR-TS质粒组未见相应基因及蛋白表达。经血清饥饿诱导后,Western blot检测显示随着去血清时间的延长,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化、Beclin-1蛋白逐渐增加、P62蛋白逐渐减少。结论成功构建了工具载体pIRES/TgDHFR-TS和重组载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,且能在真核细胞中表达,表达的弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)能促进血清饥饿诱导的细胞自噬。     

人Ⅱ型大麻受体真核表达体系构建及其在 HEK293细胞中的表达

目的：构建人Ⅱ型大麻受体（ hCB2）基因GV230真核表达质粒,并检测hCB2基因在HEK293细胞中的表达。方法利用人脑皮质细胞的总RNA为模板,RT-PCR获得cDNA,通过酶切、连接及测序鉴定正确后,再将目的片段插入真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCB2,阳性克隆用脂质体瞬时转染HEK293细胞。激光共聚焦扫描显微镜和Western blotting法检测hCB2基因表达产物在细胞的表达情况。结果扩增出hCB2基因片段,成功构建了重组表达质粒,并检测到目的蛋白在转染细胞中表达,观察到hCB2受体在胞膜分布和表达。结论成功构建GV230-hCB2质粒,该质粒在HEK293细胞中能表达hCB2蛋白,此为进一步研究hCB2生物学功能奠定了实验基础。     

人BRAF野生型及V600E突变型真核表达载体的构建及表达

目的:构建BRAF野生型和V600E突变型真核表达载体;转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株,为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生发展中的作用提供合适的细胞模型.方法:将BRAF野生型及V600E突变型cDNA克隆于真核表达载体pCMV-Myc中,构建pCMV-Myc-BRAFW)及pCMV-Myc-BRAFV600E重组质粒,酶切鉴定、测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染胰腺癌细胞Panc-1,经G418培养筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达.结果.酶切鉴定和序列分析证实,重组克隆pCMV-Myc—和pCMV-Myc—BRAFV600E序列正确,RT-PCR和Western blot结果显示G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E.结论:成功构建了pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAFV600E真核表达载体,建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.     

靶向mcl-l基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的: 构建靶向髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法: 设计3对针对mcl-1基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNAfi片段的真核表达质粒(shRNAl-3)并行酶切鉴定和测序分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2中,48 h后测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western blot检测mcl-1 mRNA和蛋白表达情况.结果: 重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功.质粒在HepG2细胞中的转染率约为64%.shRNAl-3导入HepG2细胞48 h后.mcl-1,mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(0.61±0.02,0.56±0.02,0.46±0.01 vs 0.97±0.01,0.95±0.00;0.53±0.01.0.48±0.03,0_36±0.01vs0.90±0.03.0.88±0.01,均P<0.01).与shRNAl和shRNA2相比,shRNA3对mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强(52.6%VS 36.3%,42.9%:63.2%vs41.5%,49.6%,均P<0.01).结论: 成功构建并筛选出的靶向mcl-1的shRNA真核表达质粒对肝癌细胞HepG2内的mcl-1表达具有明显抑制作用.     

刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。     

幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmMDNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性。方法RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体。测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认。通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性。结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的HpglmM序列有96%的同源性。PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1。重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符。ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上。结论成功构建了pVAX1-glmMDNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础。