DAPI标记骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型大鼠脑内的迁徙和定位

背景：骨髓间充质干细胞作为载体细胞行脑内移植治疗胶质瘤,如何证实其为最好的药物载体？ 目的：将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入模型鼠脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位。 方法: 体外培养骨髓间充质干细胞。利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型。将DAPI标记于培养好的骨髓间充质干细胞上,利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第3,7天处死大鼠,利用共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的分布及与肿瘤细胞的关系。 结果与结论:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型。以DAPI标记的骨髓间充质干细胞。在模型鼠脑内主动聚集于肿瘤血管周围,并能与肿瘤细胞发生融合。结果证实骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体。     

骨髓间充质干细胞移植修复肾损伤

背景：研究发现外源性骨髓间充质干细胞能够定居于肾脏并且分化为肾脏细胞，参与损伤肾组织的修复，但对其修复作用途径尚无公认。 目的：探讨外源性骨髓间充质干细胞移植对肾损伤的可能治疗作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2007-03/09在南昌大学泌尿外科研究所完成。 材料：清洁级SD大鼠56只。雄鼠8只用于制备骨髓间充质干细胞，雌鼠48只随机分为细胞移植组、模型对照组、假手术组，16只/组。荧光染料DAPI为Biotium Inc产品，蓖麻血凝素为Vector Laboratories产品，BrdU为Sigma产品。 方法：以密度梯度离心法分离鼠骨髓间充质干细胞，加入DAPI进行标记，调整细胞数为1.5×1010 L-1。细胞移植组、模型对照组建立缺血再灌注肾损伤模型，假手术组开腹后不予结扎肾血管。缺血45 min后，细胞移植组经下腔静脉注入用DAPI标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，模型对照组、假手术组输入1 mL无菌生理盐水。移植后各组每天腹腔注射BrdU，其后留取血标本和肾组织。 主要观察指标：荧光显微镜及免疫组织化学染色观察移植细胞在肾组织中的分布，采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素鉴定移植细胞的分化，以免疫组化方法检测Brdu反映肾组织细胞的增殖状况，检测血清肌苷、尿素氮水平。 结果：移植后第3天可见少量DAPI阳性细胞，第4天DAPI阳性细胞数明显增加（P < 0.05），且多数DAPI标记细胞能结合蓖麻血凝素，DAPI阳性细胞主要分布于肾脏外髓质肾小管中，肾皮质和内髓质阳性细胞很少，而肾小球内则未见DAPI阳性细胞。假手术组肾组织细胞增殖非常弱，移植后第4天Brdu阳性细胞数明显低于模型对照组（P < 0.05）；移植后第2，3，4天细胞移植组Brdu阳性细胞均明显多于模型对照组（P < 0.05），其分布类似于DAPI阳性细胞。与模型对照组比较，细胞移植组大鼠血清尿素氮水平移植后第1，2天明显降低（P < 0.05）；细胞移植组大鼠血清肌苷水平移植后第1，2，3天均显著降低（P < 0.05）。 结论：移植的外源性骨髓间充质干细胞能够迁移、定居于缺血再灌注损伤后的肾组织中并分化为肾小管上皮细胞；骨髓间充质干细胞移植可促进损伤肾脏本身的细胞增殖再生；对肾损伤后早期肌苷、尿素氮的升高具有一定抑制作用，这种早期对肾功能的保护与其迁移定居到肾脏局部、分化修复损伤的肾小管无关。     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞*

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

骨髓间充质干细胞移植清除急性肺损伤大鼠的肺泡液体

背景：肺泡液体增多是急性肺损伤的重要病理生理改变,而修复受损的肺泡-毛细血管膜屏障是减轻肺水肿的有效途径。 目的：探讨骨髓间充质干细胞移植对内毒素诱导急性肺损伤模型大鼠肺泡液体的清除作用。 方法：采用改良的Peister法分离培养大鼠骨髓充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液。将大鼠随机分为3组,急性肺损伤组和骨髓间充质干细胞干预组采用腹腔注射内毒素建立急性肺损伤模型。成功造模1 h后,干预组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL(细胞数1×106个),对照组和损伤组同法予以等量生理盐水。各组在尾静脉注射后6,24,48 h,检测肺泡液体清除率、肺水含量程度测定,观察肺组织病理变化。 结果与结论：肺水含量程度测定湿干比肺损伤组在24 h点与其他组比明显升高(P < 0.05);细胞移植组湿干比在各时间点与肺损伤组比明显降低(P < 0.05)。细胞移植组在各时间点肺泡液体清除率与肺损伤组比明显升高(P < 0.05)。苏木精-伊红染色光镜观察,肺损伤组6 h点表现为毛细血管充血,肺泡腔内炎性细胞浸润,24 h点加重;细胞移植组6 h点肺泡腔内炎性细胞浸润较肺损伤组轻,24 h点继续减轻,48 h点基本接近正常对照组。提示,骨髓间充质干细胞移植可能通过能修复受损的肺泡-毛细血管膜屏障从而增加急性肺损伤大鼠肺泡液体清除。     

创伤性脑组织匀浆对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的：骨髓间充质干细胞在脑组织匀浆诱导环境下可以转化为神经元样细胞，损伤脑组织匀浆的骨髓间充质干细胞培养液中，不仅有脑组织中提取的生长因子，而且有骨髓间充质干细胞分泌的多种生长因子，共同刺激骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。实验观察了创伤后24 h和正常脑组织匀浆诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的差别。 方法：实验于2007-03/08在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。①实验材料：体质量100~150 g的健康SD大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，4~6周龄,清洁级。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取1只 SD大鼠，麻醉后分离股骨和胫骨，用培养基冲洗骨髓腔，离心弃上清液，加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基重悬，接种于培养瓶培养并传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。采用Gruncr改良法制作中度脑损伤大鼠模型，取伤后 24 h和正常大鼠脑组织匀浆，对体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行诱导。③实验评估：在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并应用免疫细胞化学技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶的表达，比较创伤后和正常脑组织匀浆两组诱导率差别。 结果：骨髓间充质干细胞经创伤性脑组织匀浆培养基诱导24 h后，细胞的胞体变大，36 h后部分细胞分化，回缩成圆形或梭形，48 h后部分细胞可见两个或多个突起伸出，类似神经元。免疫细胞化学技术检测显示，创伤性脑组织匀浆培养基诱导组神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（54.28±6.03）%，正常脑组织匀浆诱导分化率较前者低，神经元特异性烯醇化酶阳性表达为（32.76±3.25）%，细胞生长状态略差。 结论：脑组织匀浆可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，创伤性脑组织匀浆可明显促进其分化。     

骨髓源性肝样细胞门静脉移植大鼠肝纤维化模型

背景：研究已证明,骨髓间充质干细胞在体内、体外均可转化为肝细胞样细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能。 目的：将骨髓间充质干细胞诱导分化的肝样细胞移植到同种大鼠已纤维化的肝脏,观察其分布、分化情况及对肝功能的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/2008-03在泸州医学院附属医院实验室完成。 材料：100 g清洁级雄性SD大鼠10只用于分离培养骨髓间充质干细胞并诱导分化为肝样细胞。200~250 g清洁级雄性SD大鼠 75只,随机分为肝样细胞移植组30只,模型对照组30只,正常对照组15只。肝样细胞移植组及模型对照组大鼠腹腔注射四氯化碳制备肝纤维化动物模型。 方法：模型对照组和正常对照组大鼠门静脉输注不含血清的低糖DMEM培养基,肝样细胞移植组输入DAPI标记的肝样细胞,移植后第1,2,3,4周处死大鼠,留取肝脏和血清标本。 主要观察指标：肝组织Masson三重染色分期评估纤维化程度。肝脏冰冻切片荧光显微镜下观察肝样移植细胞定居情况。以全自动生化分析仪与放射免疫法检测血清肝功能指标和血清肝纤维化指标。 结果：肝样移植细胞逐渐从血管进入肝脏实质,最终散布于肝细胞间,移植3周后,荧光衰减明显。移植后第2周,肝组织中的假小叶逐渐吸收或消散,纤维化程度明显轻于模型对照组,胶原染色变浅,分布于纤维间隔和汇管区,肝细胞呈气球样变性。移植后第4周肝细胞排列接近正常,偶见点状坏死,无纤维间隔,血清肝功能指标和肝纤维化指标与正常对照组相比,差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：诱导的肝样细胞植入纤维化的肝组织后,细胞可停留于汇管区和肝细胞索,植入细胞最早可见于移植后第7天,血生化检查结果提示植入诱导的肝样细胞能够部分替代肝细胞的功能。     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠慢性胰腺损伤

背景：慢性胰腺炎是以胰腺慢性炎症损伤及纤维化为主要病理特征的慢性进展性疾病，骨髓间充质干细胞可能在其治疗中具有潜在价值，但目前这一领域的研究尚不多见。 目的：观察骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤的修复作用并探讨其治疗机制。 方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定；采用胆胰管逆行注射油酸法制备Wistar大鼠慢性胰腺炎模型，随机数字表法分为假手术组、模型组、间充质干细胞治疗组。间充质干细胞治疗组造模后20 d经尾静脉注射间充质干细胞生理盐水细胞悬液1 mL(含细胞3×106)，第40天和第60天各重复1次；模型组经尾静脉注射等体积生理盐水；假手术组不进行十二指肠穿刺及胆胰管逆行注射，其余操作同模型组。3组动物均于治疗结束后取胰腺组织行病理组织学检查；并检测胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性。 结果与结论：经间充质干细胞治疗的慢性胰腺炎大鼠胰腺病变程度及纤维化程度显著减轻；胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性显著降低(P < 0.01)。提示骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤有显著的修复作用，其机制可能和抑制结缔组织生长因子、转化生长因子β产生、抑制炎症反应、减少胶原增生有关。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死后心电生理异常和左室重构的影响

背景：目前干细胞移植修复梗死心肌及改善心脏功能这一作用已被接受,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械藕联,是否易形成一个有收缩功能的相对电独立体系,并产生移植后严重的恶性室性心律失常等尚缺乏系统观察。 目的：观察心肌梗死大鼠行同种异体骨髓间充质干细胞移植后,其心电生理异常及左室重构情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-12/2008-10在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组、盐水对照组、细胞移植组,30只/组。另取1月龄健康Wistar大鼠数只用于抽取骨髓。 方法：取体外培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞,加入诱导剂5-氮胞苷使之转化为心肌样细胞,在移植前2 h行DAPI标记。盐水对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。结扎后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,其余3组注射等量生理盐水。 主要观察指标：体表ECG及心电生理检测,UCG检测左室功能,左室病理检查测定梗死面积,荧光显微镜下观察DAPI标记的供体细胞迁移、分布情况。 结果：骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为自发搏动的心肌样细胞,表达心肌特异性肌钙蛋白T,并形成肌丝结构。细胞移植后4,8,12周与盐水对照组比较,细胞移植组PR间期、QRS时限和心室有效不应期缩短,而室颤阈值增加(P < 0.05);左室收缩末期内径减小,左室射血分数、左室短轴缩短率均显著增加(P < 0.05);移植后8,12周心肌梗死面积明显缩小 (P < 0.05)。移植后4周,在荧光显微镜下梗死区可见DAPI标记带蓝色荧光的移植骨髓间充质干细胞细胞核,至12周仍然存在,但随移植时间延长荧光强度逐渐减弱。 结论：骨髓间充质干细胞具有分化为心肌样细胞的可塑性,同种异体骨髓间充质干细胞移植可有效改善心肌梗死后的心电生理异常和左室重构。     

人骨髓间充质干细胞移植老年性痴呆大鼠认知能力和海马超微结构的变化

背景：因发病机制不明,目前尚无治愈老年性痴呆的有效方法。现临床上主要是采用药物治疗,而骨髓间充质干细胞的替代治疗尚处于基础研究阶段,其海马移植后对老年性痴呆认知能力的影响未见报道。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆大鼠认知能力和海马超微结构的影响。 方法：老年雄性Wistar大鼠30只,制备自然衰老痴呆模型,造模后随机分为3组,选取双侧海马为移植区,分化细胞移植组注射定向神经细胞诱导分化的人骨髓间充质干细胞悬液4 μL(2×105个细胞),干细胞移植组注射等量常规培养的人骨髓间充质干细胞,模型组注射等量生理盐水。通过Y迷宫试验测定大鼠的学习、记忆能力,透射电镜观察海马区超微结构。 结果与结论：与移植前大鼠学习、记忆分数比较,移植后12周模型组均显著下降(P < 0.01),干细胞移植组均有所提高(P > 0.05),分化细胞移植组均显著提高(P < 0.01)。移植后12周与模型组比较,干细胞移植组、分化细胞移植组大鼠学习、记忆分数均显著提高(P < 0.01)。电镜观察模型组大鼠海马区神经细胞可见明显损伤,干细胞移植组损伤减轻,分化细胞移植组多数神经细胞结构正常。证实骨髓间充质干细胞移植可以提高老年性痴呆大鼠的认知能力,且定向神经诱导分化的骨髓间充质干细胞移植治疗效果优于未分化的骨髓间充质干细胞,提示骨髓间充质干细胞减少海马组织神经细胞变性坏死可能是其改善老年性痴呆大鼠认知功能障碍的作用机制之一。     

大鼠骨髓来源肝干细胞的成瘤性*★

背景：通过动员自身或移植外来的骨髓来源肝干细胞可促进肝再生，但是，在大规模临床应用前，其安全性需要进一步研究。 目的：采用含体积分数5%淤胆血清的培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化，将这些骨髓来源肝干细胞接种到裸鼠体内，观察其是否具有成瘤性。 方法：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞；以免疫荧光法检测白蛋白、甲胎蛋白及细胞角皮素18在诱导后细胞的表达；以糖原染色及尿素合成检测细胞功能。 将培养14 d的大鼠骨髓来源肝干细胞接种于裸鼠皮下，观察局部有无新生物形成。 结果与结论：用含体积分数5%淤胆血清的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞，4 d后出现细胞集落，细胞为圆形；7 d后集落变大，其周围开始出现多角形细胞；培养14 d后可见细胞呈多角形和排列成铺路石样，免疫荧光染色发现这些细胞表达角皮素18、甲胎蛋白和白蛋白，糖原染色显示细胞内有糖原颗粒；培养第12~15天的培养液中尿素氮浓度逐渐升高。经诱导的大鼠骨髓来源的肝干细胞接种到裸鼠皮下，30 d后局部未见新生物形成，组织结构未见异常。结果提示用体积分数5%淤胆血清培养基诱导的大鼠骨髓源性肝干细胞可能无成瘤性。     

核转染对成体骨髓源性干细胞的影响

背景：成体骨髓源性干细胞是实施细胞治疗的重要细胞来源。对成体骨髓源性干细胞的示踪,是研究其移行、分化的规律与机制并进一步阐明再生潜能、疗效的关键。 目的：探讨经转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞,在细胞表型、增殖能力、心肌分化潜能是否存在的影响。 方法：应用核转染技术利用U-23程序将编码maxGFP报告基因的载体对成体骨髓呈克隆样干细胞进行转染,应用MTT法对核转染前后的生长曲线进行测定,使用3 μmol/L 5-氮胞苷对核转染前后成体骨髓呈克隆样干细胞进行向心肌分化诱导,并利用RT-PCR对向心肌分化的特异性标记物GATA4与MLC-2v的表达进行测定。使用成年SD大鼠心肌梗死左前降支结扎模型,对使用经maxGFP转染的成体骨髓呈克隆样干细胞施心内注射并于注射后的第2天和第7天对经注射心脏行冰冻切片并观察maxGFP在体内的表达情况。 结果与结论：经核转染24 h后,第47代及第119代成体骨髓呈克隆样干细胞的转染率为49.4%和43.1%,转染后5 h,开始出现呈绿色荧光阳性的细胞,经核转染后仍能保持小圆球形、可贴壁、呈克隆样生长。MTT检测结果显示：核转染前后第47代及第119代均具有相似的生长曲线。核转染前第47代及119代细胞平均群体倍增时间分别为8.57,10.28 h;核转染后分别为9.42,10.42 h,各代前后比较差异无显著性意义(P=0.551,P=0.774)。RT-PCR检测结果显示：核转染前5-氮胞苷处理前后均表达GATA4,处理后MLC-2v条带更强;核转染后5-氮胞苷处理前后均表达GATA4,处理后MLC-2v条带更强,上述2个向心肌分化指标于转染前后变化并不明显。体内实验结果：心内注射经核转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞,第2天及第7天可在经注射心肌中发现有少量绿色荧光阳性的细胞。提示,核转染可快速地将外源基因导入细胞,经核转染后的成体骨髓呈克隆样干细胞仍能保持其细胞形态、增殖能力及向心肌分化潜能,然而,经maxGFP基因核转染的成体骨髓呈克隆样干细胞,移植入心肌后只有少数细胞能表达经转染基因。     

成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化：利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达：将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征，在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应，在双层软琼脂不能形成细胞克隆；骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达，而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达：将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成，亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征．体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性．体外的培养条件没有使其发生恶性转化．从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。     

体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察*

背景：目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少。 目的：体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性。 方法：取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5 mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。待细胞达80%~90%融合后,胰蛋白酶消化传代。取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Von Kossa’s染色检测成骨诱导分化潜能。 结果与结论：原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形态和活性与传代细胞没有明显差别。P3~P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后生长速度减缓。羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa’s矿化结节染色呈阳性。证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化。     

小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存

树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能,成为肿瘤抗原的良好载体。获得大量的树突状细胞,对于肿瘤疫苗的研制具有重要作用。 目的：对小鼠骨髓树突状细胞进行诱导、培养、扩增及冻存,并对比冻存后复苏细胞与未冻存细胞的细胞特性,寻找一种能够大量获得树突状细胞及有效储存的方法。 方法：取小鼠骨髓细胞,在含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(10 μg/L)和重组小鼠白细胞介素4(5 μg/L)的完全培养基中对其进行诱导、培养及扩增。培养第6天,对培养获得的树突状细胞在加有冷冻保护剂DMSO的完全培养液中冻存。复苏后,在培养基中加入脂多糖、对细胞诱导,获得大量的成熟树突状细胞,最终获得的树突状细胞与未进行冻存的细胞在细胞活力、形态学、细胞表型、混合淋巴细胞反应等方面对比。 结果与结论：复苏后,(82.2±4.73)%细胞存活,存活的细胞经脂多糖诱导后发育为成熟树突状细胞,在形态学、细胞表型及混合淋巴细胞反应等方面与未经冻存的树突状细胞差异无显著性意义。提示小鼠骨髓源性树突状细胞冻存复苏后,细胞生物学特性与未冻存的细胞无明显差别,用冻存的方法储存树突状细胞,能够避免在不同时期应用细胞时反复进行培养,可以获得大量的同质细胞。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经类细胞分化

BACKGROUND： Chemical induction has been shown to be effective at promoting the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs）. However, these inductors have cytotoxicity side effects that may damage cells over time. Traditional Chinese medicines avoid this disadvantage while still producing effective induction.
OBJECTIVE： To investigate the influence of RadixAstragafi （Huangql） on the differentiation of MSCs.
DESIGN, TIME AND SETTING： In vitro study of traditional Chinese medicine in neural stem cell differentiation. The experiment was performed at the Central Laboratory of Hebei North University between April and June 2007.
MATERIALS： Radix Astragafi solution （lot No. 060105; license No. Z53021585） was purchased from Dali Pharmaceutical Co., Ltd., China; rabbit anti-rat nestin, rabbit anti-rat neuron-specific enolase （NSE）, mouse anti-rat microtubule-associated protein 2, and rabbit anti-rat glial fibrillary acidic protein were purchased from Wuhan Boster, China.
METHODS： Whole bone marrow was isolated from the femur and tibia of 6-week-old male Wistar rats and subcultured. The fourth passage of MSCs were harvested and induced by different concentrations （50, 100, 200, 400 g/L） of Radix Astragali.
MAIN OUTCOME MEASURES： Hematoxylin-eosin staining was used to observe MSC morphology after 24 hours of induction. Immunocytochemistry was employed to observe the expression of NSE （specific neuronal marker）, nestin （marker of neural stem cell）, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 （markers of astrocytes）.
RESULTS： Following Radix Astragali treatment, changes occurred in cell morphology including： cell body pyknosis; thin and long processes formed in some cells, with growth corresponding to drug concentration and induction time; and the formation of network-like connections between some cells. With increasing drug concentration and induction time, nestin expression was upregulated, and the number of positive cells increased; cells produced NSE, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2; nestin was expressed earlier than glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 expression. In addition, the number of NSE-positive cells was increased significantly more than glial fibrillary acidic protein-positive cells.
CONCLUSION： Radix Astragafi promoted process formation in stem cells. It may induce the differentiation of MSCs into neural stem cells, and subsequently into neuronal- and glial-like cells. Radix Astragafi exhibits stronger inductive effect on neuronal differentiation than glial differentiation of MSCs.     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定*☆

背景：当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞。 目的：通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础。 方法：绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分子CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-lectin和DiI标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能。 结果与结论：绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3~5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%;免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达。细胞能同时吞噬FITC-labeled BS-1-lectin,DiI-ac-LDL阳性率达85.3%。证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞。     

Delta opioid receptors mediate chemotaxis in bone marrow-derived dendritic cells

Endogenous opioid peptides are locally produced at the inflammatory site where antigens are captured and processed by dendritic cells (DCs). Subsequently, maturing DCs migrate towards draining lymph nodes to initiate T cell response. Given the primordial role of DCs in adaptive immune response, we examined whether opioids may affect the migratory response of DCs. We found that the delta opioid receptor (DOR) mRNA was expressed at low level in bone marrow-derived immature DCs and up-regulated upon DC maturation. Moreover, DOR agonists triggered DC chemotaxis in vitro. In vivo, enkephalins prevented the egress of mature DCs injected into the peritoneal cavity of normal mice. This effect was inhibited by blocking opioid receptors on mature DCs. The cross-talk between CCR7 and DOR receptors that are both up-regulated during DC maturation was then examined. Whereas opioids did not alter the migratory responsiveness to CCR7 ligands, DOR-mediated mobilization of mature DCs was inhibited by CCL19 and CCL21 suggesting that the opioid chemotactic activity decreases as the concentration of the chemokines increases.     

骨髓和脂肪来源间充质干细胞的免疫调节作用☆

背景：脂肪来源的间充质干细胞是否具有和骨髓来源间充质干细胞类似的免疫调节作用? 目的：观察骨髓来源和脂肪来源间充质干细胞的免疫学特征。 方法：分离骨髓和脂肪来源的间充质干细胞，分别检测它们对T细胞周期、活化、抑制和增殖的作用情况。 结果与结论：骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞同样具有抑制T细胞增殖的能力，在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T细胞增殖中这种作用都是具有剂量依赖性的，在1︰2时有极强的抑制作用，但是在1︰100时这种作用基本消失，在共培养时骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞都可以使更多的T细胞被抑制在G0/G1期，同时也可以抑制T细胞的早期活化，但是上述作用脂肪来源的间充质干细胞均较骨髓来源间充质干细胞弱，且脂肪来源的间充质干细胞并不具有抑制T细胞凋亡的作用。