嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及其抗原相关基因的表达

目的 构建嗜热吸水链霉菌cDNA文库并进行表达序列标签(EST)测序,从中筛选具有毒力作用的基因进行体外克隆并诱导表达.方法 利用RNA转录5’末端转换技术构建致农民肺嗜热吸水链霉菌的cDNA文库,将平板内克隆进行编号,取前1020个克隆提取质粒,进行EST测序.用生物信息学方法分析EST测序结果并预测基因功能,从中筛选出可能引起人体免疫反应的毒力因子.将这些目的基因亚克隆入pET-28a载体,将重组子转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导相应蛋白的表达.结果 成功构建了较高质量的嗜热吸水链霉菌cDNA文库,得到有义序列978个,获得单一基因347个,其中2段基因分别与胸膜肺炎放线菌外膜蛋白、转铁蛋白B的同源性为51％和42％,其开放阅读框长度分别为1554 bp和726 bp,分别编码517和241个氨基酸.将2段基因亚克隆入原核表达载体中,IPTG诱导表达产物的相对分子质量分别为63 000和30 000.结论 所构建的嗜热吸水链霉菌cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,文库中的EST数据将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选.     

抗疟疫苗的成功是否近在眼前?

继Nussenzweig等去年发现猴疟原虫子孢子抗原的基因结构以后,Dame与Enea等最近报道了恶性疟原虫子孢子抗原的基因结构。Dame等人发现恶性疟原虫循环子孢子基因是由三个部分组成的一条长链,这三个部分为:头段、中段和末段。在中段上载有遗传密码,它由41个4-密码重复单位组成,其相应的氨基酸顺序为:天冬酰胺—丙氨酸—天冬酰胺—脯氨酸。但在41重复单位中有4个单位的氨基酸排列不同于其他的,为天冬酰     

抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链基因的串联及克隆

目的：制备抗日本血吸虫虫卵尿素溶性抗原单克隆抗体33F5的基因工程单链抗体。方法：利用杂交瘤细胞总mRNA抽提、逆转录技术及PCR方法、获得单抗重链和轻链可变区基因，通过linker将其连接，并克隆到表达载体PCANTAB5E中。结果：酶切显示，重链和轻链可变区基因及ScFv片段与预设计的大小一致。结论：获得抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链串联的基因克隆。     

肺曲菌瘤

曲菌引起的肺部疾病多种多样,通常将曲菌病分为3种类型:侵入型、过敏性支气管肺型和腐生型。侵入型通常发生在免疫功能低下的患者,表现为霉菌直接侵入肺实质和血管;过敏性支气管肺型是支气管树中的霉菌所引起的各种免疫反应的临床表现;腐生型又称肺曲菌瘤,本文将着重讨论之。流行病学特点:病曲菌瘤的准确发病率尚不清楚。英国胸腔与结核肺协会根据X线结果发现肺结核空洞患者中11～17%都有肺曲菌瘤。曲菌孢子在自然界中普遍存在,因此,患者很少与职业性接触有关。曲菌瘤可发生在任何年龄,包括儿童,而以老年人最为常见。分离出的曲菌种类通常为烟曲菌,但也有报告为黑曲菌、黄曲菌和构巢曲菌等。病理特点:曲菌瘤的组织病理特征为一种由纵横     

艾滋病合并肺部真菌性疾病的影像学表现

艾滋病患者伴发的真菌感染几乎包含了所有已发现的致病真菌及某些对正常宿主来说是非致病真菌的菌种。其中浅部致病真菌主要有皮肤癣菌和酵母菌,深部致病真菌有隐球菌、球孢子菌、副球孢子菌、曲霉菌、马尔尼菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌和肺孢子菌等。肺部真菌感染占深部真菌感染的首位,主要侵犯支气管、肺。随着对艾滋病合并肺部真菌感染认识的提高,发病率有逐年上升的趋势。在我国艾滋病最常并发肺部感染的真菌是白色念珠菌、新生隐球菌、曲霉菌等,     

检测肺孢子菌巢式PCR方法的建立及其敏感性和特异性研究

目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银（GMS）染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体（光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体）为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%（14/20）,对照组检出率为0（0/20）。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%（20/20）,对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义（P〈0.05）。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。     

恶性疟原虫云南株环子孢子蛋白部分基因的克隆和序列分析

目的：测定我国恶性疟原虫环子孢子蛋白部分基因序列，了解我国虫株与其它虫株CS蛋白基因序列的差异。方法：采用PCR方法特异性扩增CS蛋白基因片段，并将该基因片段克隆于M13噬菌体，取3个阳性克隆制备M13－CSP单链DNA，用双脱氧链末端终止法测定该基因片段核苷酸序列。应用PCGENE软件对六个虫株CS蛋白基因序列进行了一系列比较分析。结果：我国恶性疟原虫云南株（PFD－3／YN）与T4、Welcome、NF54、3D7及7G8等虫株CS蛋白基因序列有不同程度的差异，其中一个有意义核苷酸突变发生在P．fTh／Tc抗原表位区。结论：云南株与其它虫株CS蛋白基因存在差异。     

链霉菌DrrAB外排系统的研究进展

链霉菌产生两类重要的抗肿瘤药物阿霉素和柔红霉素,链霉菌通过ABC家族的DrrAB外排泵将这两种抗生素运输到细胞外。本文对DrrAB外排系统的结构,DrrA和DrrB蛋白的表达与相互作用以及该复合物的装配和多药外排功能的研究进展做一简要综述。     

RNA干扰在抗肝纤维化治疗中的应用前景

1RNAi研究的发展简史1990年,Jorgensen和Mol领导的研究小组对矮牵牛花进行研究时发现,将一个能产生紫色色素的基因置于启动子之后导入矮牵牛花中,想通过色素基因不断复制来加深花朵紫色,结果发现不但没有加深,反而大多数花却成了花斑甚至白色。他们把这种现象称为共抑制（cosuppression）。1994年Cogoni等将外源类胡萝卜素基因导入链胞菌,结果使转化细胞中的内源性类胡萝卜素基因受到了抑制,当时这种现象被称为消除作用。     

搔痒与哮喘

成人和儿童在颏和颈或背部偶而感到搔痒时,预示哮喘即将发作,这些感觉与霉菌孢子季节性高峰有关,因为在别的季节进行鼻部和支气管激发试验,也可出现相同的症状,搔痒通常恰在气道阻塞开始前发生。疼痛也可能是前驱症状:在7～9月一位妇女的左上颌出现原因不明的间歇性疼痛,患者对季节性霉菌(蚕霉菌)非常敏感,该霉菌可引起哮喘与鼻炎,这点已由冬季鼻部阳性激发试验所证实,病人自述除     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅱ.一种新的化学拼接法重组多价保…

将恶性疟原虫保护性抗原环子孢子蛋白、环状体感染红细胞表面抗原、裂殖子表面抗原１和２（ＭＳＡ１和ＭＳＡ２）４种抗原中具有Ｔ和／或Ｂ细胞表位的６个基因片段，按照我们设计的方案排成一条线性序列，经在计算机上分析比较后，分成长短不一的８个基因片段（Ｆ１－Ｆ８），其中Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５和Ｆ７为正链片段，Ｆ２、Ｆ４、Ｆ６和Ｆ８为负链片段。每相领两个片段间预设１５个互补碱基搭头，在ＤＮＡ合成仪上分别合成这８个片段     

肺孢子菌感染或定植与呼吸系统疾病的相关性探讨

目的 检测呼吸疾病患者肺内肺孢子菌基因阳性率,探讨肺孢子菌定植或感染的影响因素及其与呼吸系统疾病的相关性。方法 设计3对特异性引物,构建检测肺孢子菌16S rRNA基因的LAMP反应体系。通过对大鼠感染模型的肺孢子菌基因检测,验证其敏感性和特异性;通过对临床呼吸疾病患者痰液样本肺孢子菌基因的检测,分析肺孢子菌感染或定殖与呼吸系统疾病的相关性及其影响因素。结果 本研究建立的LAMP方法检测肺孢子菌16S rRNA基因的最低检测极限为50 copies/mL;与念珠菌等8种呼吸道病原体不发生交叉反应。共收集和检测98例呼吸疾病患者痰标本,肺孢子菌基因总检出率为63.3%(62/98)。合并呼吸道感染者63例,非合并感染者35例,肺孢子菌基因阳性率分别为60.3%和75.0%,χ²检验两者差异有统计学意义。肺部影像学有改变者肺孢子菌基因检出率为72.5%,肺部影像学无改变者检出率为53.19%,χ²检验两者具有显著性差异。COPD和非COPD患者肺孢子菌基因检出率分别为53.2%和71.2%,χ²检验两者无显著性差异;COPD急性发作期和稳定期阳性率分别为66.8%和46.9%,χ²检验两者差异无统计学意义。CD4⁺ T淋巴细胞数降低患者肺孢子菌基因检出率80.0%;CD4⁺ T 淋巴细胞数正常者的检出率为60.27%,χ²检验两者差异具有统计学意义。1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和含量正常患者的肺孢子菌基因检测结果显示,χ²检验两者差异无统计学意义。结论 呼吸疾病患者中肺孢子菌基因检出率较高。两者是否有直接的因果关系尚需进一步研究。合并其他细菌感染者肺孢子菌基因阳性率较低,其机制有待于进一步研究。CD4⁺ T细胞数降低者肺孢子菌基因阳性率升高,符合肺孢子菌为机会感染的特点。     

异基因造血干细胞移植过程中并发播散性阿萨希毛孢子菌感染1例并文献复习

目的:提高对异基因造血干细胞移植患者并发播散性阿萨希毛孢子菌感染的认识。方法:报告国内首例非血缘全相合造血干细胞移植过程中并发阿萨希毛孢子菌败血症患者的临床表现、治疗方法及效果。结果:患者,女,7岁,诊断重型再生障碍性贫血行非血缘全相合造血干细胞移植,+7d患者高热、感染性休克,4次血培养中均见白色念珠菌及阿萨希毛孢子菌生长,经伏立康唑联合两性霉素B治疗后患者体温逐渐正常。结论:阿萨希毛孢子菌是免疫缺陷及肿瘤患者中罕见的条件致病菌,在造血干细胞移植过程中并发阿萨希毛孢子菌败血症为国内首例,应用伏立康唑联合两性霉素B治疗本病疗效显著。     

AIDS合并急性播散性荚膜组织胞浆菌病的真菌学诊断

目的 为了提高对艾滋病(AIDS)合并播散性荚膜组织胞浆菌病的实验诊断水平。方法 取患者血液、骨髓涂片直接镜检，及血液、骨髓真菌培养，观察荚膜组织胞浆菌分别于25℃及37℃孵育时的菌落特征，镜下形态特点。结果 荚膜组织胞浆菌为双相型真菌，生长缓慢，25℃培养为霉菌相，无色素，白色绒毛样或棉花团样菌落，镜下可见特征性的齿轮状或棘状大分生孢子；37℃孵育时为酵母相，镜下可见圆形、卵圆形2～4μm的孢子。结论 从患者体内检出荚膜组织胞浆菌是诊断荚膜组织胞浆菌病的金标准。     

糖尿病并发曲霉菌性肺炎一例病例报告

血糖控制不良的糖尿病患者,接触含霉菌孢子的媒介,孢子进入体内,容易导致难治性感染。本文结合病例及文献复习,提出霉菌感染的诊疗路径,并为长期接触霉菌群体如农民群体及免疫功能低下者提供一定的指导。     

深部真菌感染病原学诊断概述

真菌广泛存在于自然界中 ,其中约 5 0余种对人体致病 ,2 0余种能引起全身感染。近年来 ,真菌感染显著增加 ,如国内报告尸检中 ,深部真菌感染的患病率已由 5 0年代初期的 0 3%上升至 11 3% ,其中支气管、肺真菌病占 5 0 %～6 0 % ,以白色念珠菌感染为常见 (占 90 % ) ,其它尚有新型隐球菌、毛霉菌、放线菌、诺卡菌等。球孢子菌病和组织胞浆菌病则为美洲 ,非洲等大陆常见的地区性真菌病。1　真菌的形态学特征深部真菌感染的诊断 ,特别是病原学的诊断 ,了解真菌的形态学等特征尤为重要。真菌的营养体包括菌丝和菌丝体。前者由成熟的孢子在基质…     

真菌生物被膜的研究进展

真菌生物被膜对患者病死率的影响已经逐渐引起临床医师的重视。产生生物被膜的真菌中，白色念珠菌最为人们熟知，同时，非念珠菌属，如酵母菌类的新型隐孢子菌以及霉菌类的烟曲霉菌也可以引起生物被膜相关感染。真菌生物被膜独特的生长过程，包括黏附、定植、增殖和播散，都有复杂的分子作用机制。强有力的抗真菌治疗仍然是对付真菌生物被膜的最有效的办法。     

大鼠源卡氏肺孢子菌p55抗原基因克隆和序列分析

目的克隆大鼠源卡氏肺孢子菌55kDa抗原（p55）基因。方法取肺孢子菌病大鼠肺组织制备肺孢子菌DNA，并以此模板扩增p55基因，将PCR产物与pGEM—T载体连接．转化E．coli DH5a．在含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上筛选出重组子，提取质粒进行PCR扩增、酶切鉴定、序列测定及序列比较分析。结果p55基因体外扩增产物长度为l286bp，重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子，测序结果与文献报道同源性为99．8％。结论成功扩增了p55基因，并插入克隆载体pGEM—T中。p55基因的克隆为进一步建立基因分型、疫苗等研究打下基础。     

经腹腔注射建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型的研究

目的经腹腔注射建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型。方法 BALB/c小鼠用环磷酰胺致免疫低下后,腹腔注射不同浓度白色念珠菌SC5314,观察小鼠不同时间血液常规、肾脏真菌载量和组织病理变化。结果白色念珠菌SC5314孢子浓度在2×106～5×107个/ml间的5种0.1ml菌液均造成小鼠系统感染白色念珠菌,病理表现以注射2×107个/ml孢子组小鼠最为典型,在心、肺、肾、脑、横膈、肠系膜等组织内均可见真菌孢子和菌丝。结论经腹腔注射白色念珠菌SC5314可成功建立免疫抑制BALB/c小鼠系统念珠菌感染模型,最适感染剂量为每鼠0.1ml的1×107～2×107个孢子/ml菌液。     

烟曲霉Bem46基因荧光定位菌株构建及对极性生长相关基因影响作用初探

目的 构建以eGFP作为荧光标记的烟曲霉Bem46基因定位菌株,观察其在烟曲霉不同形态中的定位情况,初步明确该基因对极性生长相关基因Bem1、Bud5表达的影响。方法 运用分子生物学方法将烟曲霉Bem46基因克隆入质粒pUCGH,构建荧光定位载体。原生质体法转化烟曲霉获得该基因定位菌株并验证。激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉孢子、芽管以及菌丝状态下分布情况。RT-PCR观察对照菌株Ku80和ΔBem46中极性生长相关基因Bem1、Bud5的表达量。结果 通过全基因克隆成功获得烟曲霉Bem46基因定位菌株并经PCR验证。激光共聚焦显微镜下绿色荧光在孢子中弥散分布,在孢子即将发芽时荧光在孢子一侧聚集,并随着芽管形成,荧光在极性生长的一侧延伸分布于整个菌丝中,在菌丝形成侧枝膨大处可见荧光明显聚集。RT-PCR结果表明ΔBem46中基因Bem1、Bud5表达量均较对照菌株有所下降。结论 烟曲霉Bem46基因可能同孢子发芽、菌丝发生侧枝的极性生长相关;且该基因缺陷可影响极性生长相关基因Bem1、Bud5表达。