Tie-2在人脐静脉内皮细胞中的表达及意义

目的 探讨酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidemal growth factor homology domains,Tie-2)基因在人脐静脉内皮细胞株ECV304中的表达,为进一步研究Tie-2在肿瘤血管生成中的作用提供实验基础.方法 传代人脐静脉内皮细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化(SABC法、DAB显色)对人脐静脉内皮细胞株ECV304中的Tie-2基因的蛋白表达情况进行检测.结果 相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,SABC法检测到Tie-2蛋白在人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞膜、细胞浆和核膜中均呈深棕色颗粒.结论 Tie-2在ECV304细胞株中呈强阳性表达.     

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的构建人内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,并在ECV 304中获得表达. 方法将ESM-1 cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中,转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交,免疫组化检测ESM-1基因的表达.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现ESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加. 结论成功构建了人 ESM-1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV304, 并获得高水平的表达,为进一步研究作好准备.     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用.方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响.采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡.结果Ad-Vasostatin(MOI分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P＜0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变.以MOI为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P＜0.01).结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用.     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用。方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-Vasostatin(MO I分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P<0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以MO I为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。     

Lipopolysaccharide upregulates the expression of Toll-like receptor 4 in human vascular endothelial cells

目的：探讨内皮细胞TLR2和TLR4的表达以及内毒素对其表达的影响。方法：按RNA提取试剂盒说明书提取内毒素作用后的ECV-304(人脐静脉内皮细胞株)和人脐静脉内皮细胞总RNA,运用逆转录PCR(RT-PCR)检测细胞TLR2和TLR4mRNA的表达。结果：人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞株均能表达TLR2和TLR4mRNA,但是,TLR4的表达水平明显强于TLR2的表达,LPS能明显上调TLR4的表达,但对TLR2的表达无影响。结论：本研究提示TLR4能明显上调LPS作用的信号转导分子,在LPS对内皮细胞的激活效应中具有重要的作用;ECV-304是内皮细胞研究的良好的实验模型,可代替人脐静脉内皮细胞而较为广泛应用。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

不同拉伸力加载培养对人血管内皮细胞增殖情况的影响和意义

目的 探讨外在不同强度机械拉伸力加载对体外培养人血管内皮细胞生长的影响和相关生长因子的表达情况,以及其在临床负压治疗中的指导意义.方法 对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞加载不同拉伸力干预,实验分6组,分别加载FX-5000T应力系统不同大小拉伸力(拉伸度分别为0、5%、10%、15%、20%、30%)后,利用CCK-8 法检测细胞增殖情况,qRT-PCR检测血管形成因子相关基因VEGF、Flk-1、Tie-2 表达水平,提取相关蛋白 WB检测Flk-1、Tie-2 蛋白表达水平.结果 各应力加载培养组细胞活性下降,且应力越高细胞活性越低;各应力组细胞内VEGF、Flk-1、Tie-2基因的表达呈不同程度下调趋势,且应力越高,VEGF、Flk-1、Tie-2的表达越低;各应力组细胞内Flk-1、Tie-2的蛋白表达呈下调趋势,且呈现一定的剂量依赖性,即应力越高,Flk-1、Tie-2的蛋白表达越低.结论 外在拉伸力对人血管内皮细胞生长增殖有一定影响,且长时间超生理范围的拉伸力对人血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用.     

ESM-1在转染MEK基因的ECV304细胞中的表达

目的探讨内皮细胞特异性分子-1（ESM-1）在转染MEK基因的人脐静脉内皮细胞中的表达,探讨ESM-1的表达是否受分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号转导通路的调节。方法脂质体转染高活性的MEK基因人ECV304细胞,Western blot检测ESM-1在ECV304细胞中的表达。结果成功获得稳定转染高活性MEK基因的细胞株,并检测到胞外信号调节的激酶（ERKs）的表达量在二株细胞中没有变化,而pERK-2和ESM-1在转染MEK基因的细胞中表达高于未转染的细胞。结论ESM-1可能处于ERK-2的下游,其表达可能受MAPK信号转导通路的调节。     

三七总皂苷促血管内皮细胞增殖的实验研究

目的 探讨三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响.方法 用不同浓度三七总皂苷对ECV304细胞进行干预培养,采用四唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;荧光定量聚合酶链反应法(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测VEGF、KDR mRNA的表达;Western blot法检测增殖相关蛋白ERK1/2和pERK1/2蛋白的表达.结果 三七总皂苷在一定浓度范围(100、200、400、800mg/L)能够促进ECV304细胞增殖(P＜0.05),呈明显的剂量依赖性,48h后作用最明显,细胞增殖率分别达112.44％±5.64％、117.20％±11.05％、134.34％±0.40％、141.45％±5.49％;与对照组比较,PNS组ECV304细胞VEGF、KDR mRNA表达量,增殖相关蛋白pERK1/2的表达均明显提高(P＜0.05).结论 三七总皂苷能够促进ECV304细胞增殖,其机制可能与上调VEGF、KDR和pERK1/2有关.     

低氧状态下血管内皮细胞HIF-1α表达及与细胞凋亡的关系

目的探讨低氧对人脐静脉内皮细胞ECV304凋亡及低氧诱导因子-1α表达的影响及意义。方法人脐静脉内皮ECV304细胞分为低氧处理组和对照组,处理后MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡;应用荧光实时定量PCR(QPCR)和Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和HIF-1α的mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,低氧处理能明显抑制细胞的增殖,且抑制作用随着低氧处理时间的延长而增强(P<0.05);低氧处理细胞后凋亡率明显增加,且呈时间依赖性(P<0.05);QPCR和Western blot结果显示,低氧处理组细胞Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05),Bcl-2则明显下降(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著降低,且呈时间依赖性(P<0.05)。低氧呈时间依赖性上调HIF-1α的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。结论低氧能促进人脐静脉内皮细胞ECV304细胞凋亡,其机制可能与HIF-1α表达上调及Bcl-2的表达降低、Caspase-3和Bax的表达升高有关。     

腺病毒携带人内皮抑素基因在舌癌细胞和血管内皮细胞中的表达

【目的】以腺病毒携带的人内皮抑素基因 Endostatin基因 (Ad/hEnd)感染舌癌细胞株Tca8113和人脐静脉内皮细胞株ECV30 4,观察其在舌癌细胞和静脉内皮细胞株中的表达。【方法】用 2 93细胞扩增Ad/hEnd ,并抽提、纯化。以 10MOI的Ad/GFP感染ECV细胞 ,观察细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例。采用免疫组化法检测Endostatin蛋白在感染了Ad/hEnd的Tca细胞和ECV细胞中的表达。Ad/hEnd感染Tca细胞后收集细胞培养液上清 ,ELISA检测上清中Endostatin蛋白含量。Western blot检测Endostatin蛋白在Tca和ECV细胞中的表达。【结果】扩增的Ad/hEnd通过空斑形成试验准确测定其滴度可达 1× 1 0 1 0 ～ 8× 1 0 1 0 PFU/mL。表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例为 31 %。实验显示感染Ad/hEnd后 ,在Tca细胞和ECV细胞胞浆内有Endostatin蛋白合成。细胞培养液上清中Endostatin蛋白表达浓度呈时间剂量依赖关系 ,最高达到 5 97μg/L。Western blot检测显示Endostatin蛋白可在两种细胞中高效表达 ,相对分子质量与自然Endo statin蛋白一致 ,无杂合蛋白 ,呈剂量依赖关系 ,且持续到第 7天仍呈明显的Endostatin蛋白质条带。【结论】本实验制备的重组腺病毒Ad/hEnd能在舌癌细胞和血管内皮细胞中有效表达Endostatin蛋白 ,可用于抗     

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响

目的观察抗人血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特性的影响。方法将抗人VEGF发夹状核酶（RZ）基因构建的pcDNA3.1＋/RZ转染ECV304细胞,经G418筛选后,用RT-PCR法鉴定RZ基因在ECV304细胞中的转录,用MTT法和流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞增殖活力和细胞周期,ELISA法检测细胞上清VEGF的表达水平。结果RZ基因在ECV304细胞中获得转录,它不改变细胞增殖活力和细胞周期,但能明显下调VEGF的表达。结论抗人VEGF发夹状核酶能够显著抑制ECV304细胞VEGF的表达,为进一步开展核酶的肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白所致内皮细胞功能的影响

目的探讨银杏黄酮苷元(GA)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导脐静脉内皮细胞株ECV304单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的调节作用。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附反应(ELISA)、SP免疫组化法等,探讨ox-LDL诱导下内皮细胞表达MCP-1、LOX-1及银杏黄酮苷元的干预作用。结果6.25～25 mg/L银杏黄酮苷元与脐静脉内皮细胞株ECV304共同培养6～48 h可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞MCP-1、LOX-1 mRNA和蛋白表达(P0.05),具有浓度、时间效应关系(P0.05)。LOX-1拮抗剂PIA可抑制ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1、MCP-1 mRNA和蛋白表达(P0.05)。结论银杏黄酮苷元可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞黏附因子MCP-1表达,该作用可能通过抑制LOX-1的表达来实现。     

TGF-β1基因特异性shRNA真核表达载体的构建及其基因抑制作用

目的:构建针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体并评价其在人脐静脉内皮细胞株中对TGF-β1基因的抑制作用,筛选出高效的表达载体以用于后续的RNAi研究.方法:利用生物信息学方法设汁shRNA,在人TGF-β1基因的mRNA序列中选择靶序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核件酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒.构建2个表达载体PCenesil-TGF-β1-1(pT11)和PGenesil-TGF-β1-2(pT12),酶切及测序证实后转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中,错构载体(pHK)为阴性对照.转染后采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TGF-β1mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TGF-β1蛋白质的表达.结果:酶切及测序证实表达载体pT11、pT12构建成功,两个表达载体的转染率为38.2%和40.1%,两个表达载体对人脐静脉内皮细胞株TGF-β1基因的转录抑制率为58.1%和60.0%,蛋白表达抑制率为38.9%和44.3%.结论:成功构建的针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体对脐静脉内皮细胞株FGF-β1基因的转求有明显的抑制作用,并以表达载体pT12的效果为优,为后续移植肾肾病基因治疗的研究奠定了基础.     

地塞米松诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：观察地塞米松对人脐带静脉血管内皮细胞( ECV304)增殖的影响。方法：采用细胞凋亡的荧光检测法（Heochst 33342）检测地塞米松对脐静脉血管内皮细胞（ECV304）的形态学改变, MTT 法观察地塞米松对ECV304增殖的抑制作用,流式细胞仪术检测地塞米松引起的ECV304凋亡率改变。结果：较高剂量（100umol/L）地塞米松对脐静脉血管内皮细胞增殖起抑制作用,并诱导其凋亡。结论：地塞米松具有比较明显的抑制血管内皮细胞增殖的作用。地塞米松抗血管生成的机制可能与其抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

三氧化二砷抗肝癌血管新生作用

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)注射液抗肝癌血管新生的作用及其相关机制。方法:采用MTT法、透射电镜观察、免疫组化、鸡胚尿囊膜(CAM)血管形成实验等方法,观察As2O3注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长、超微结构、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达以及对CAM血管形成的影响。结果:As2O3能显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长,用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡超微结构改变;As2O3对SMMC-7721细胞和ECV304细胞VEGF、EGFR的表达均有抑制作用;As2O3能抑制CAM血管形成。结论:As2O3注射液具有显著抗肝癌血管新生作用,其机制与抑制血管内皮细胞生长、诱导血管内皮细胞凋亡、调控肿瘤血管新生相关因子VEGF和EGFR的表达密切相关。     

姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的:探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响。方法:采用MTT法,台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系,Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用;通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2 mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性,免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果:姜黄素对ECV304的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性,Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg/mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡,凋亡率分别是21.6%和34.7%;在10μg/mL姜黄素作用24 h下,MMP-2的mRNA显著减少,其分解明胶的活性也显著降低,免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论:姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

心肌成纤维细胞诱导体外血管新生的实验研究

目的探讨心肌成纤维细胞在血管新生中的作用。方法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF),并收集其条件培养液(cardiacfibroblastconditionedmedium,CF CM)作为ECV304[人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcellstrain)]细胞的培养液,用3H TdR掺入法检测CF CM对ECV304细胞增殖活性的影响;采用体外血管新生三维模型,检测其是否能诱导ECV304细胞向凝胶内侵入。结果乳鼠心肌成纤维细胞的条件培养液明显促进ECV304细胞增殖(P<0.01),诱导ECV304细胞向凝胶内侵入迁移生长,形成树枝样发芽结构。结论心肌成纤维细胞的条件培养液可促进ECV304细胞增殖和迁移,即有促血管新生作用。     

核因子kappaB的诱骗性寡核苷酸对肿瘤坏死因子-α诱导的细胞间粘附分子-1表达的影响

目的 探讨人脐静脉内皮细胞中，核因子kappaB(NF-kB)的诱骗性寡核苷酸对肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的细胞间粘附分子(ICAM)-1表达的影响。方法 采用培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304，脂质体介导法转染寡核苷酸，以流式细胞仪检测转染效率，电泳迁移率转换试验检测诱骗性寡核苷酸与NF-kB转录因子的亲和力及特异性，并以RT-PCR和流式细胞仪测定其对TNF-α诱导的粘附分子ICAM-1表达的影响。结果 诱骗性寡核苷酸能与NF-kB特异结合，并可显著下调TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1的表达。结论 NF-kB的诱骗性寡核苷酸可显著下调NF-kB调控的与动脉粥样硬化相关的粘附分子的表达，为核酸药物防治动脉粥样硬化的临床应用提供一些前期资料。     

高迁移率族蛋白B1对血管内皮细胞ECV-304活化作用的研究

目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGBI)诱导血管内皮细胞活化的信号转导机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)株ECV304,并将其分为对照组、HMCBl刺激组、丙酮酸乙酯(EP)处理组,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清TNF-α水平变化、免疫荧光显微镜观察血管内皮细胞NF-KB活性的变化、凝胶迁移率实验(EMSA)检测细胞内NF-K B DNA结合活性的变化.结果 HMGBl可诱导人脐静脉内皮细胞NF-KB在短时间内活化,促进TNF-α表达;EP处理后可显著降低NF-KB活性,抑制TNF-α表达.结论 HMGBl可能通过活化血管内皮细胞NF-K B进而诱导TNF-α分泌,参与脓毒症的病理生理过程.EP可通过拮抗HMGBl刺激血管内皮细胞NF-KB活化从而发挥保护作用.