安徽阜阳既往献血人群HIV-1感染者基因变异特征的研究

目的研究安徽省阜阳市既往献血人群中HIV-1感染者体内病毒流行株的亚型及序列变异特征。方法用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）对HIV-1外膜蛋白（env）基因和核心蛋白（gag）基因进行扩增,获得244例患者的env基因V3-C3及其邻近区域序列和245例患者的gag基因区序列,应用MEGA软件进行分析,同时结合患者的疾病进展阶段进行相关性研究。结果系统进化树显示安徽省阜阳市患者体内HIV病毒的env和gag区序列属泰国B亚型;env和gag区的组内基因距离分别为9．11％和3．59％;按CD4细胞绝对计数分层,随CD4细胞绝对计数降低,env、Gag组内基因距离明显升高;随病毒载量水平增加,各组基因距离有增大的趋势,且差异均有统计学意义（P〈0．001）。env区V3环序列13份长期不进展者7份顶端四肽为GPGQ,53份缓慢进展者33份顶端四肽为GPGR,两者间差异有统计学意义（P=0．038）。结论安徽省阜阳市既往献血人群HIV-1感染者体内的病毒流行株是B′亚型。CD4和病毒载量作为疾病进程不同阶段的指标,与病毒变异有相关性,即随CD4降低、病毒载量升高病毒组内基因距离增大。HIV B′亚型V3环顶端四肽随疾病进展由GPGQ为主变为GPGR为主。     

1997～2002年山东省HIV-1流行株env基因序列测定和亚型分析

①目的对1997～2002年间山东地区HIV-1各亚型分离株进行基因分型，了解各亚型的分布及其与传播途径的相互关系。②方法采集1997～2002年间山东省38例HIV-1感染者的抗凝全血标本，用巢式PCR技术扩增外周血单个核细胞中HIV-1前病毒env基因C2～V3区，并对C2～V3区的核苷酸序列进行测定和分析。⑧结果山东省38例HIV-1分离株中存在亚型和重组毒株4种（A、B、C、A／E）。其中A亚型5株，B亚型22株（其中包括泰国B亚型11株），C亚型10株，A／E重组毒株1株。各亚型内的离散率有差异，A、B、c亚型内基因离散率分别为1．5％、8．6％和1．9％。在性乱人群和静脉吸毒人群中以A亚型和C亚型为主；在职业献血和不安全血制品使用者中以B亚型为主。④结论1997～2002年间山东省HIV-1流行特点为A、B、c亚型共存，伴有重组毒株；传播途径复杂，基因变异较大，B亚型仍然为主要流行株。     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒的核酸异质性及准种特点的研究

目的研究Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)膜蛋白基因(env)的准种与变异特点.方法采用巢式PCR方法对5例艾滋病患者血浆HIV-1env基因C2～V3区进行PCR扩增,产物经纯化后克隆至pMD-18T载体中,每例患者分别挑取5～8个克隆,共34株,完成阳性克隆的鉴定、抽提纯化和测序,将获得的DNA序列及氨基酸序列进行分析,并计算其氨基酸同源替换率(ds)与非同源替换率(dn)的比值.结果同一患者体内HIV准种株平均为83.5%,各克隆株之间的核苷酸同源性在88%～99%之间;不同患者之间的核苷酸同源性在75%～91%;34株序列的V3区平均变异频率明显高于C2～C3区(P＜O.05);而V3区和C2～C3区的ds/dn比值均＞1.结论艾滋病患者体内有大量HIV准种存在,基因的变异在V3区发生较频繁,免疫选择压力在该区变异中不起主要作用.     

HIV相关神经认知紊乱患者配对组织来源的HIV-1 env基因特征分析

目的：探讨人类免疫缺陷病毒相关神经认知紊乱（HIV associated neurocognitive disorder, HAND）患者不同组织中HIV-1 env基因的变异进化特征。方法通过国际HIV痴呆量表筛选出HAND患者,获得其血浆及脑脊液来源的HIV-1 env基因核苷酸序列,回顾性分析遗传多样性、氨基酸长度、潜在糖基化位点（PNGS）、辅助受体利用以及特征性氨基酸的特点及组织间差异。结果本研究纳入4例HAND患者共57条HIV-1 env基因V3-C4序列（血浆来源29条,脑脊液来源28条）。脑脊液中的HIV-1遗传多样性高于血浆来源毒株,差异有统计学意义（遗传多样性变异度中位数分别为0.053和0.007,P=0.043）。3例患者脑脊液与血浆来源的毒株均使用CCR5辅助受体,其中2例患者脑脊液（患者D 158 bp,患者F 158 bp）中的HIV-1 V3-C4区氨基酸长度中位数明显长于血浆来源（患者D 156 bp,P=0.017;患者F 157 bp,P=0.003）。脑脊液与血浆中HIV-1 env基因序列相比共有16个氨基酸位点存在明显差异,62.5%（10/16）分布在V4区。结论 HAND患者脑脊液和血浆中的HIV-1 env基因特征存在差异,脑脊液中的HIV-1准种遗传多样性更高。     

河南省部分地区HIV流行毒株的基因序列测定及亚型分析

目的:了解河南省内HIV-1流行株的亚型及序列变异特征.方法:在河南省尉氏县采集42例有偿献血HIV-1感染者静脉血,分离单个核细胞(PBMC),用套式聚合酶链反应(nest-PCR)对单个核细胞中前病毒脱氧核糖核酸(DNA)的膜蛋白(env)基因进行扩增,并对其C2-V3及邻区350～450个核苷酸序列进行测定和分析.结果:42份样品间的基因离散率为7.4%.与国际A-E亚型参考序列及部分地区B'亚型代表株序列相比较,河南省尉氏县的42个毒株及流行与我国云南德宏、四川等地的B'亚型毒株序列接近,均属于泰国B'亚型,基因离散率为6.72%系统树分析显示,42份样品仍和泰国B'亚型聚集,远离其他国际亚型.对V3环四肽序列的分析表明,具有泰国B'亚型基因型GPGQ的30例,具有欧美B'亚型的GPGR的7例.结论:根据以上数据及其它资料提示,目前河南省尉氏地区的既往献血人群中,泰国B'亚型依然占主导地位,该流行区毒株的传入与流行在云南德宏州的相同亚型HIV-1毒株密切相关.但是根据其离散率及系统树的结果提示,既往献血人群中泰国B'亚型有向其他亚型进一步变异的趋势,应引起有关部门的注意.     

深圳市HIV-1主要流行株外膜蛋白V3环氨基酸变异分析

目的 了解深圳市HIV-1主要流行株膜蛋白V3环氨基酸变异情况。方法 收集深圳市1996—2010年HIV确认阳性样本389份,应用巢式聚合酶链反应（Nested-PCR）技术,对样本膜蛋白(Env)基因V3-V4区进行扩增,并对核苷酸序列进行测定,判定亚型结果。对获得的CRF01_AE、CRF_BC、B’和B重组株/亚型的核酸序列进行比对和翻译,分析其V3环氨基酸变异情况。结果 227例CRF01_AE重组株V3环顶端四肽主要为GPGQ(184/227,81.1%),199例(87.7%)可预测使用CCR5辅助受体,12例(5.3%)使用CXCR4辅助受体;55例CRF_BC重组株V3环顶端四肽主要为GPGQ(54/55,98.2%),50例(90.9%)可预测使用CCR5辅助受体,5例(9.1%)不能预测;49例B’亚型毒株V3环顶端四肽主要为GPGR(39/49,79.6%),25例(51.0%)可预测使用CCR5辅助受体,3例(6.1%)使用CXCR4辅助受体,21例(42.9%)不能预测;10例B亚型毒株V3环顶端四肽主要为GPGR(5/10,50.0%),8例(80.0%)可预测使用CCR5辅助受体,2例(20.0%)使用CXCR4辅助受体。CRF01_AE、CRF_BC、B’和B亚型毒株V3环净电荷数分别为3.29±0.97(n=227)、3.11±0.42(n=55)、3.73±0.93(n=49)和3.50±0.97(n=10)。结论 深圳市HIV-1 V3 环顶端四肽主要为GPGQ和GPGR,病毒辅助受体使用以及表型预测结果表明深圳市HIV-1的流行仍以复制速度较慢的非合胞体诱导型病毒为主。     

HIV-1广谱中和活性样本膜蛋白基因序列特征分析

目的分析广谱中和活性感染者不同时间点HIV-1膜蛋白基因的序列特征。方法应用单拷贝基因组扩增技术(Single genome amplification,SGA)扩增获得不同时间点样本的全长膜蛋白(Env)基因,分析Env基因可变区序列长度、糖基化位点数目、细胞嗜性及中和表位关键氨基酸的变异。结果系统进化分析显示在5个不同时间点获得的98条全长Env基因为HIV-1 B’亚型毒株;毒株序列随时间推移基因距离增加,V1V2区序列长度变化大于V4区,V3区与V5区序列长度保持恒定;Env基因共享序列有27个潜在糖基化位点(PNGS),V1V2区的糖基化位点数目变化较大,MPER区次之,V3区数目恒定;部分毒株嗜性随时间推移发生了从CCR5到CXCR4的转变;Env基因与广谱中和活性相关的特征氨基酸位点的突变率在4.76%~100.00%间。结论广谱中和活性感染者不同时间点的Env基因序列差异随时间推移而增加,中和单抗识别的关键位点氨基酸存在不同类型和不同程度的突变,表明广谱中和活性感染者体内毒株在免疫压力下持续进化。     

无偿献血人群中HIV-1感染者env基因序列特征研究

目的 分析我国无偿献血人群艾滋病病毒I型（HIV-1）感染者病毒亚型及env基因C2-V4区序列特征。方法 针对我国13个省市献血人群筛选的115例HIV-1阳性标本,扩增HIV-1的env基因C2-V4区片段并测序;构建最大似然树（Maximum Likelihood）分析不同亚型env基因序列的进化关系;分析该基因区序列变异以及2G12、PGT135、PGT128中和表位特征。结果 从115例HIV阳性标本中成功扩增C2-V4区76份,经测序分析发现HIV-1基因亚型7种,其中,亚型CRF01_AE和CRF07_BC所占比例最高,分别占46.0%（35/76）和39.5%（30/76）,其他亚型CRF08_BC、B、CRF65_CPX、CRF59_01B、CRF61_BC所占比例分别为5.3%（4/76）、5.3%（4/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）。V3环顶端四肽存在GPGQ、GPGR、GPGK、GQGR四种类型,辅助受体以CCR5（90.8%）为主。97.1%的CRF01_AE毒株分别缺失2G12和PGT135抗体识别的相关糖基化位点,而CRF07_BC毒株100%缺失2G12抗体识别相关的糖基化位点,80%毒株未缺失PGT135抗体识别相关的糖基化位点。结论 我国献血人群HIV-1感染者以CRF01_AE和CRF07_BC为主要流行毒株;各毒株亚型V3顶端四肽以GPGQ变异型为主,且主要使用CCR5为辅助受体;2G12、PGT135及PGT128中和抗体表位呈现不同程度的变异。该研究为进一步开展针对献血人群的艾滋病预防与控制提供了参考数据。     

广东省人类免疫缺陷病毒1型CRF01_AE毒株膜区V3环氨基酸序列多态性分析

目的 分析广东省人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE毒株膜蛋白第三高变区(V3环)氨基酸序列的特点。方法 提取HIV-CRF01_AE亚型感染者PBMC中前病毒DNA,巢式PCR扩增HIV-1膜基因c2v3c3区域后测序,对V3环氨基酸序列特征进行分析。结果 73份样本与HIV-CRF01_AE亚型代表毒株聚集在一起、与其他亚型标准毒株分开,进一步证实本研究73例HIV/AIDS患者感染的HIV-1毒株为CRF01_AE亚型。除6个位点氨基酸一致外,73例病人所有V3环序列的其他29个位点分别有2~8个不同的氨基酸出现;GPGQ为V3环顶端四肽的主要形式,占47.9%,其次为GPGK,占15.1%,四肽中未出现多态性的只有第三位氨基酸;预测HIV-1辅助受体为CCR5的有35例,占47.9%,其次为CXCR4的有34例,占46.6%,两者之间差异无统计学意义（P>0.05）。性传播是广东省CRF01_AE亚型HIV-1感染者的主要感染途径,占54.8%,其次是静脉吸毒,占30.2%。通过性传播途径感染的HIV-1毒株的辅助受体主要为CXCR4,占52.5%,辅助受体为CCR5的占40.0%,两者相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论 广东省人类免疫缺陷病毒1型CRF01_AE毒株膜区V3环氨基酸存在较高的多态性,使用CCR5及CXCR4为辅助受体的HIV-1毒株比例相近。     

山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定

①目的 了解山东省1型人类免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子流行病学特征。②方法 应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV－1前病毒基因组的env基因C2－V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列。③结果 8株HIV－1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%-5.2%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象。④结论 山东省的HIV－1分离株以B亚型HIV－1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV－1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式。     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

Subtype and sequence analysis of HIV-1 strains in Heilongjiang Province

Background Human immunodeficiency virus (HIV-1) is divided into two types, HIV-1 (groups M, N and O) and HIV-2. Heilongjiang Province located in the northeast of China, and the feature of the subtype distribution and sequence characteristics of HIV-1 strains prevalent in Heilongjiang Province is still uncertain. The aim of this study was to investigate the subtype distribution and genetic characteristics of HIV-1 strains in one hospital in Heilongjiang Province. Methods HIV-1 env gene was amplified by nested-PCR from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 19 HIV-1 seropositive individuals in Heilongjiang Province. The C2-V3 region was sequenced. Aligned the nucleotide sequence of 19 samples with CLUSTAL W (BioEdit) software, results were acquired and used for phylogenetic tree analysis after artificial adjustment. Reference sequence, downloaded from Los Alamos HIV Sequence Database, was used to identify the subtype of obtained sequence. Genetic distance between sequences was assessed using the software MEGA 3.1 Kimura 2-parameter, and the Phylogenetic tree was reestablished with Neighbor-Joining method.Results Phylogenetic tree analysis showed that 19 Heilongjiang strains clustered closely to subtype B strain from Thailand and were far from other international subtype reference strains. Statistical test showed no significant discrepancy between the genetic distance of interclass and intra-class (P>0.05). The analysis of V3 loop amino sequence of 19 Heilongjiang B strains revealed that V3 tip motif of 10 samples (52.63%) was GPGQ, and of 4 samples (21.53%) was GPGR.Conclusions The subtype of 19 HIV-1 seropositive individuals in Heilongjiang Province is B’, and it is introduced from He’nan Province. V3 tip motifs of the HIV-1 isolates are mainly GPGQ and GPGR.     

我国人类免疫缺陷病毒-1主要流行株外膜蛋白基因V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸分析

目的鉴定我国HIV-1主要流行毒株亚型的env,V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸,并阐明其在追踪传染源和研究疫苗中的作用。方法应用nested—PCR对157份来自我国12个省份的HIV-1毒株env区序列进行扩增,并使用ABI377型测序仪测序,然后应用BLAST、GCG、MEGA和VESPA等生物学软件或程序对env基因V3-V4区及其临近区域序列进行基因型鉴定、系统树分析及特征性氨基酸鉴定。结果157份样本包括54份B′(34．40％)、61份B′／C(38．85％)和42份CRF01-AE(26．75％)毒株。系统树分析结果显示,B′亚型毒株序列均与B．CN．RL42十分接近,B′／C毒株主要与97CN54A和97CNGX6F聚成一簇。而CRF01—AE序列与THCM240和97CNGX2F聚在一起．而且分别聚成明显不同的两个亚组。特征性氨基酸分析发现,我国B′和B′／C毒株分别具有8个保守的特征性氨基酸,而且与代表株的相同位点氨基酸基本一致。而CRF01-AE重组毒株具有11个保守的特征性氨基酸,其中有9个位点与97CNGX2F和TH.CM240不一致。包括这9个特征性氨基酸的样本主要来自除云南省以外的其他省份。结论目前流行于我国的B′和B′／C毒株具有单一的共同传染源,而CRF01-AE毒株可能是通过不同输入源或不同传播途径先后从泰国传入我国的。这将对我国艾滋病防治策略的制定和正在进行的疫苗研究具有重要的指导意义。     

东莞市艾滋病病毒1型的分子流行病学研究

目的了解东莞市不同人群中艾滋病病毒(HIV)各亚型毒株的流行情况和传播规律。方法采集东莞市经蛋白印迹法确认的24名HIV感染者的外周抗凝血,分离单核细胞、提取核酸后用套式聚合酶链反应扩增HIV-1膜蛋白(env)基因C2-V3区的核酸片段,进行序列测定,鉴定病毒亚型。用威斯康星GCG软件进行共享序列、基因离散率的计算和毒株的聚类分析。结果在24份阳性标本中,有13份标本PCR扩增阳性,亚型分析结果表明东莞市存在HIV-1B和CRF01-AE两种亚型。结论HIV-1B和CRF01-AE可能是东莞市艾滋病病毒流行的主要亚型。     

HIV-1中国流行株的生物学表型与V3环序列变异相关性初步研究

目的分析我国HIV-1流行株的生物学表型及其与V3环序列变异的相关性。方法采用传统的共培养方法从HIV-1感染者新鲜外周血单个核细胞(PBMC)中分离病毒并在MT-2细胞上测定分离株的融合诱导性,用表达CD4和趋化因子受体CCR5或CXCR4的GHOST(3)测定毒株的辅助受体利用情况,用巢式一聚合酶链反应(nest—PCR)扩增V3环及两侧区序列并对其序列进行测定,用GCG软件分析氨基酸序列。结果在所分析的5个原代毒株中,LTG0213和LTG0214为合胞体诱导型(SI),利用CXCR4辅助受体;XJN0021、XJN0091和SHXDC0041为非合胞体诱导型(NSI),利用CCR5辅助受体。X4／SI病毒和RS／NSI病毒在V3环氨基酸序列方面,存在明显的区别。CCR5表型中国株第8、11、18及第25位氨基酸的共同基序为：8-TXXS／GXXXXXXR／QXXXXXXE／D-25,CXCR4表型株在这些位置出现碱性氨基酸取代(第25位除外),引进正电荷。结论HIV-1中国流行株的生物学表型与V3环序列变异密切相关,V3环上第8、11、18及第25位积累碱性氨基酸(或由酸性氨基酸转变为中性氨基酸),可以使病毒由NSI／R5表型转变为SI／X4表型,可以根据V3环氨基酸序列预测病毒的生物学表型。     

云南瑞丽县IDUs人群HIV-1感染者毒株env基因C2-V3区序列的测定

①目的 了解云南瑞丽县１９９４年以后静脉药瘾（ＩＤＵｓ）人群ＨＩＶ－１感染者分离株的分子流行病学特征。②方法 运用套式聚合酶链反应扩增ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因Ｃ２－Ｖ３区,将扩增片段纯化后与ｐＥＧＭ５ｚｆ（＋）载体连接,再克隆入大肠杆菌,提取重组质粒,使用ＤＮＡ自动测序仪进行序列测定。③结果 与此地区１９８９年分子流行病学资料比较,Ｖ３区变异不显著,未发现新的亚型与毒株。④结论 ５株ＨＩＶ－１毒株进化     

灭活前后HIV-1包膜基因变异的研究

目的 深入了解ＨＩＶ在灭活因素作用下包膜基因变异。方法 对ＨＩＶ－１Ｂ３亚型毒株在Ｓ／Ｄ法及低ｐＨ法灭活作用前后的样品,套式ＰＣＲ扩增其民膜基因Ｃ２￣Ｃ３区５６４ｂｐ的核酸自段,进行核苷酸序列测定和分析。结果 两种方法活前后,包膜基因变异均不显著,核苷酸同源性均为９８％。结论 Ｓ／Ｄ法及低ｐＨ法灭活作用前后ＨＩＶ包膜基因变异不显著。体外传代ＨＩＶ包膜基因趋于稳定。