pPICZα-synBPIm600酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPI_m23重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达,拟构建synBPI_m600酵母表达载体。以pUC18synBPI₄₁₄质粒为模板扩增synBPI₂₀₀基因片段,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI_185bp基因片段;EcoRI/SalI双酶切PBV220BPI_m600质粒获得BPI_m420基因片段;将上述2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E.coliTOP10F′,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定,结果与预期相符。提示:成功构建了pPICZαsynBPI_m600酵母表达载体.     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

[目的]构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达,为开展对resistin的研究打下实验基础.[方法]酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患者腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA,RT-PCR法扩增出re-sistin基因cDNA,经测序后,PCR产物亚克隆入T载体,用EcoRI和KpnI分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS,然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接,用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒.重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1 mmol/LIPTG在32℃诱导表达2 h,裂解细菌,进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]RT-PCR扩增产物分子大小为327 bp,序列分析表明为人resistin基因完整编码区.PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后,从细菌质粒中酶切回收了目的片段.重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327 bp、4 980 bp大小的两个片段,序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区,基因编码无移位,PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39.5 kD的融合蛋白.[结论]成功构建了人resistin基因原核表达载体,且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白,为下一步研究打下了实验基础.     

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体，并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法：用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后，克隆到毕氏酵母载体PICZαA中，构建重组表达质粒pPICαA—LMP2A。pICZαA—LMP2A经SAC Ⅰ酶切线性化，采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115，经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株，用PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS—PAGE电泳和westem—b10tting分析。结果：重组质粒pPICZαA—LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS—PAGE电泳和west-em-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54Kda，与预计值相同。结论：构建了LMP2A毕氏酵母表达载体，并在酵母细胞中成功表达。     

pEGFP-C2-人类P100蛋白SN和TD片段质粒构建

目的:分别构建含有人类p100蛋白SN片段和TD片段基因的真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD。方法:利用EcoRI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒PSG5-p100-SN和PSG5-p100-TD进行双酶切以获得目的片段p100-SN和p100-TD基因片段,回收纯化后连接到质粒pEGFP-C2上。结果:通过对重组质粒进行菌落PCR鉴定以及酶切鉴定均能从PCR产物和酶切产物中观察到p100-SN和p100-TD片段。结论:成功构建了可以在真核细胞内表达绿色荧光蛋白和目的蛋白的融合蛋白的重组质粒pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD,可为有关人类p100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。     

EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.     

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法扩增人转化生长因子基因，与GFP真核表达载体连接，构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体，并用限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序，证实新质粒的构建成功。结论：应用RT-PCR方法扩增目的DNA片段，简单快捷；双酶切定向克隆可以保证构建一步到位，免去正反向重组体筛选的问题。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达

[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达

目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定。EcoRI和NotI双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证。线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0．5％甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体。结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株。经过0．5％甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质。结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达。     

啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

HBVS基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定

[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2/S基因的重组载体.[方法]设计合成2对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBVS基因、PreS2/S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.[结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符.测序结果与文献报道序列及预计结果一致.[结论]成功构建了S基因与PreS2/S基因的重组载体.     

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。     

pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建

目的 利用分子生物学技术和方法将pGAPZαA质粒改建为带有人防御素5(HD5)基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5,为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础.方法 PCR技术,以设计的引物P1/P2从克隆载体pMD18-T/HD5中扩增人防御素5基因片段,并将扩增出来的目的 基因和pGAPZαA质粒用EcoRI和XbaI双酶切后连接构成重组质粒,然后转化至E.coli Top10感受态细胞,筛选阳性克隆.最后对PCR及酶切鉴定含有目的 基因的克隆进行测序和电泳.结果 获得HD5基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的 基因的正确序列;电泳结果证明已将此片段克隆到pGAPZαA内.结论 成功构建了HD5基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5.     

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。     

丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系"饵"载体的构建及表达

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus,HCV)胞膜蛋白 2 (envelopeprotein 2 ,E2 )胞外区片段 ,构建酵母双杂交体系中“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,验证其能否用于酵母双杂交体系筛选cDNA文库。方法 :设计引物 ,从本室构建的含中国株Ⅲ型HCVE2片段的载体上 ,扩增出不包含C末端跨膜区的E2片段E2 6 6 1,经EcoRI和PstI双酶切后 ,克隆到酵母双杂交的“饵”载体pAS2 1质粒上 ,构建成载体pAS2 1 E2 6 6 1。阳性克隆经EcoRI和PstI双酶切鉴定后 ,转入酵母中 ,用酵母蛋白抽提物作Western杂交 ,证实其表达 ;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。结果 :所构建的载体 pAS2 1 E2 6 6 1双酶切后 ,片段大小正确 ;转入酵母后 ,提取酵母质粒 ,PCR扩增出预期大小的片段 ,Western杂交出现阳性条带 ;滤膜杂交 ,转有 pAS2 1 E2 6 6 1和阴性对照pLAM5 ' 1的酵母菌落没有激活报告基因 ,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色。结论 :含有HCVE2 6 6 1的“饵”载体构建正确 ,在酵母细胞中能表达出E2蛋白 ,并且没有自身激活报告基因的功能 ,能够应用于酵母双杂交体系。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.