应用抑制性消减杂交技术筛选及鉴定高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因

目的克隆高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因，探讨其分子生物学机理。方法应用抑制性消减杂交技术构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库；联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选阳性克隆进行测序和同源性分析；用Northern印迹方法证实这些基因的表达。结果成功构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库，从中筛选到15个基因，均与GenBank中已知基因有同源性。Northern印迹证实这些基因在高温致畸胚胎神经管中均呈下调表达。结论发现了高温致金黄地鼠神经管畸形过程中的一些重要相关基因并对其功能进行了初步探讨。     

高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因筛选及其鉴定

目的:筛选高温致金黄地鼠神经管畸形的上调表达基因,探讨其分子生物学机制。方法:通过抑制性消减杂交技术获得消减产物,转化大肠杆菌DH5α,构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库;联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选含插入片段的阳性克隆,进行测序和同源性分析,并经Northern杂交技术检测基因的表达。结果:成功构建高温致金黄地鼠胚胎神经管畸形的消减cDNA文库,其中2个克隆插入片段的基因序列与小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgk-1)同源。Northern杂交证实该基因在高温致畸胚胎神经管的表达较其在同龄正常胚胎神经管明显升高。结论:Pgk-1的上调表达可能与高温致神经管畸形密切相关。     

用mRNA差异显示法寻找帕金森病猴模型的相关基因

本研究采用mRNA差异显示方法，比较了在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的恒河猴单侧帕金森病模型中，双侧黑质细胞在基因表达上的不同。具体方法为制成恒河猴单侧帕金森病模型，1周后处死动物，分别取两侧黑质组织，提取总RNA。用三种锚定引物Oligo（dT）A、Oligo（dT）G、Oligo（dT）C将mRNA逆转录成为cDNA。使用试剂盒提供的部分随机引物（AP1～8，AP34）与上述几种锚定引物组合，以逆转录得到的cDNA为模板，分别进行PCR。把对照与病变侧组织相应的PCR产物在7％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经过银染，显示出差异条带。回收差异条带中的DNA并以之为模板再次进行PCR扩增，将所得片段在HindⅢ位点插入pGEM－3Zf（＋）质粒进行克隆。在所发现的数条差异条带中，初步筛选出一个长度约为310bP的DNA片段。分析此结果表明此片段具有一定特异性。     

高温致金黄地鼠神经管畸形中细胞凋亡的组织学观察

为研究细胞凋亡与高温致神经管畸形的关系，采用核固红－结晶紫染色方法和电镜技术，观察高温后胚胎发育变化。结果显示，高温后８ｈ胚胎发育迟滞，神经管延迟闭合或不闭合，胚胎各段尤期是头部的神经上皮和周围间充质的细胞凋亡比对照组增多，其超微结构改变为染色质浓缩，边聚，核膜皱缩，微绒毛消失并出现异常的包质突起；１６ｈ后细胞凋亡明显增多，胞质内出现了大量空泡，凋亡小体增多；     

mRNA差异显示法筛选小鼠精子发生相关基因

目的筛选小鼠精子发生相关基因。方法应用改良的mRNA差异显示技术对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析,并对差异表达的cDNA片段进行了克隆和测序。结果获得了27个在不同周龄小鼠睾丸组织存在明显表达差异的基因片段,其中3个片段分别与Genbank中已知基因LTBP-3、rjs、P38 MAPK基因高度同源,其余基因片段为无同源序列的新基因片段。结论上述结果表明精子发生是一个多基因参与的过程,筛选出的这些基因可能在精子发生的不同阶段调控着精子发生的全过程。     

aFGF在高温致神经管畸形中作用的免疫组织化学研究

在已建立的高温致神经管畸形的动物模型上，用免疫组织化学方法，对高温处理后的孕鼠之不同发育阶段的胚胎进行酸性成纤维细胞生长因子免疫组织化学染以，观察其在各期胚胎的神经上皮及春周围间充质，内界膜和脊索中的分布和变化。     

mRNA差异显示研究胃癌相关基因

为了克隆与胃癌发病相关的新基因，我们以正常胃粘膜细胞ＧＥＳ和胃癌细胞系７９０１为对比材料，利用ｍＲＮＡ差异显示技术，得到两个ｃＤＮＡ片段。经分析发现，分别与Ｔｒｋ基因及白血病病毒基因有８０％和３０％的同源性及较好的读框，有可能为胃癌相关的新基因片段，已在ＧｅｎＢａｎｋ中登录：１７６１１６，１７６３８５。     

应用mRNA差异显示技术克隆人肺腺癌转移相关基因

肿瘤转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征。为了探讨恶性肿瘤的侵袭和转移的机理，选择两株具有相同的细胞来源、但具有不同转移能力的人肺腺癌细胞系ＡＧＺＹ８３ａ和Ａｎｉｐ９７３作为研究材料，采用ｍＲＮＡ差异显示（ｍＲＮＡｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）技术，对这两个细胞系的基因表达差异情况进行了分析。结果显示，在这两个细胞系之间存在明显的基因表达差异，说明在低转移的ＡＧＺＹ８３ａ向高转移的Ａｎｉｐ９７３演变过程中涉及多个基因的激活与失活。研究结果还提示，在高转移的Ａｎｉｐ９７３细胞系中，某些基因的表达或高表达与人类逆转录病毒基因ＬＴＲ的整合有关。另一个克隆与人类线粒体基因ＮＤ４具有高度同源性，其高度表达与Ａｎｉｐ９７３的转移表型有关。表明肿瘤的转移是一个多基因参与的过程，由于这些基因的相互作用及细胞内外环境因素的影响，最终决定了肿瘤细胞的转移表型。     

mRNA差异显示研究进展

人类约有３０　０００～３５　０００种不同的基因,在一定时间空间内约有２％的基因表达,基因表达的变化决定了细胞行为改变。分离并克隆差异表达基因不仅有助于揭示机体正常发育和异常病理变化过程,而且可直接应用于疾病诊断和临床治疗。目前,研究差异表达基因的方法有多种,但各处有其优缺点。本文仅就ｍＲＮＡ差异显示技术（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｄｉｓｐｌａｙ,　ＤＤ）作一综述。     

快速捕获基因的方法——差异显示法

差异显示法是近年来出现的一种快速捕获基因的新方法,它的不断改进与完善,使基因表达的研究提高到一个新的水平。本文对该方法的模板、引物、差异显示和鉴定等关键问题进行了论述。     

HMGB1在高温致金黄地鼠神经管畸形神经上皮细胞中的表达变化

为了探讨高温致神经管畸形(NTDs)作用的分子机制,为预防人类NTDs的发生提供理论依据,本研究在高温致金黄地鼠NTDs模型的基础上,研究HMGB1在高温致金黄地鼠NTDs神经上皮细胞中的表达变化。将孕鼠随机分为实验组和对照组,分别于水浴处理后8、16、24、40、64 h(相当于胚龄第8、8.5、9、9.5、10.5 d)处死孕鼠,剖腹取鼠胚,制备石蜡切片,应用免疫荧光染色技术检测NTDs发生过程中HMGB1在神经上皮细胞中的表达变化。结果显示:对照组和模型组孕鼠在水浴处理后8、16、24h,HMGB1免疫阳性产物分布于鼠胚神经上皮细胞和周围间充质细胞的胞浆中;水浴后40、64 h,HMGB1表达部位出现了由胞浆向胞核的转移;高温处理后,HMGB1在实验组各期胚胎神经上皮细胞内的表达均比对照组减弱。上述结果提示,HMGB1的表达变化与神经管发育密切相关,其表达降低是高温致神经管畸形发生的重要途径之一。     

MAPKs信号转导蛋白在高温致神经管畸形中的表达

目的:探讨高温致畸中MAPKs激酶中的ERK1/2通路与JNK1/2通路蛋白表达及其作用,进一步揭示高温致畸机制。方法:在高温致金黄地鼠畸形的动物模型上,应用Western blotting技术检测对照组和高温组胚胎的丝裂原活化蛋白激酶ERK1/2及JNK1/2的表达及其磷酸化水平。结果:p-ERK1/2在对照组稳定表达;高温作用后p-ERK1/2表达与对照组相比活性降低,差异明显(P0.05);p-JNK1/2在对照组不表达,在高温组各时段均出现表达,并于高温作用后16h活性达最大值,与对照组差异明显(P0.05)。结论:高温可导致胚胎MAPKs信号转导通路中p-ERK1/2活性表达降低、p-JNK1/2活性升高,引起胚胎发育过程中细胞增殖和凋亡的失衡,从而导致胚胎先天缺陷的发生,这可能是高温致畸的一条重要途径。     

多种维生素及微量元素对高温致神经管畸形的保护作用及其对纤维粘连蛋白和层粘连蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨高温致神经管畸形(NTD)的因素及多种维生素和微量元素对NTD的保护作用。方法:实验孕鼠随机分为A组(孕前第8天开始灌服多种维生素及微量元素)、B组(孕后第1天开始灌服)和C组(不灌服)孕鼠高温处理。对各组胎鼠进行形态学观察,记录NTD发生率;用原位杂交技术检测纤维粘连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)在神经上皮细胞及其周围间充质中的转录状况。结果:(1)各组鼠胚均出现不同类型的NTD,C组NTD发生率最高,为77.5%。(2)各组鼠胚神经上皮细胞及其周围间充质中见FN和LN mRNA阳性转录信号,C组明显弱于其他组。结论:FN和LN转录降低是NTD发生的重要因素之一,多种维生素及微量元素对高温致NTD有一定的保护作用。     

高温致神经管缺陷过程中凝集素受体变化的实验动物研究

妊娠金黄地鼠随机分为实验组和对照组,前者于受精后第８天置４２℃水浴中持续２０ｍｉｎ,后者置３７℃水浴中持续２０ｍｉｎ。分别于高温后８、１２、２４、４８ｈ剖腹取胎,石蜡包埋,连续切片。应用生物素标记的花生凝集素、刀豆凝集素、麦胚凝集和荆豆凝集素为分子探针作亲合细胞化学染色,对各期鼠胚神经上皮及其基膜、脊索和神经管周围间充质中相应受体糖基进行定性、定位和半定量观察。结果显示,正常胚胎神经上皮及其周围组     

The thymic findings in stillborns with neural tube defects

Neural tube defects are among the most common congenital anomalies causing perinatal deaths. Other organ system anomalies may be associated with neural tube defects: for instance, various types of thymus pathology have been reported in these patients. In this study thymic changes were investigated in 30 stillborns with neural tube defects seen between January 1988 and June 1989. Thymic weights were significantly reduced in 14 cases and increased in 7. One patient had a double thymus, and in two cases no thymus tissue could be found. These findings suggest a primary developmental defect of the neural crest, affecting the orderly development of the thymus gland.