鼠青光眼模型中热休克蛋白27的表达及其作用

目的:探讨热休克蛋白27(HSP27)在鼠青光眼模型视网膜神经节细胞(RGCs)中的表达以及眼压对抗HSP27自身抗体的影响。方法:使用SPSS12.0软件将55只Wistar大鼠随机分为高眼压组(25只鼠)、sham对照(假手术)组(25只鼠)及正常对照组(5只鼠)。采用电凝鼠巩膜表面至少3组静脉及角膜缘周围血管,建立鼠青光眼模型。采用免疫组化和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分别检测术后1,2,3,4及8wk视网膜中RGCs以及神经纤维层(RNFL)HSP27的表达、分布以及血清中抗HSP27抗体水平。结果:随着眼压升高及高眼压持续时间延长,高眼压组右眼RGCs中HSP27表达逐渐增强,与其左眼、sham对照组右、左眼和正常对照组右、左眼比较,差异均有统计学意义(P<0.001),且RNFL中也出现HSP27的表达。高眼压组血清中抗HSP27抗体水平在术后1wk轻度升高(P>0.05),随着眼压升高及高眼压持续至术后8wk,血清中HSP27抗体水平逐渐升高并稳定于较高水平,与sham对照组和正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:内源性HSP27表达增强可能在青光眼视神经病变中具有重要作用。     

热休克蛋白27在实验性青光眼中表达的研究

目的　观察大鼠眼压升高后热休克蛋白 2 7(HSP2 7)在视网膜中的表达。方法　5 0只Wistar大鼠随机分为高眼压组和sham对照 (假手术 )组。采用电凝鼠巩膜表面至少3组静脉及角膜缘周围血管 ,减少房水静脉回流升高眼压。观察手术后 1、2、3、4及 8周大鼠眼压 ,同时免疫组化检测视网膜中HSP2 7的表达及分布情况。结果　高眼压组右眼术后眼压明显升高。术后 1周眼压 :(30 .12± 5 .18)mmHg(1kPa =7.5mmHg) ,1周后眼压基本稳定。术后各时间点高眼压组右眼眼压与术前、左眼及sham对照组右、左眼间比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。视网膜中HSP2 7阳性表达主要表现在视网膜神经节细胞的胞浆内及神经纤维层中 ,HSP2 7阳性表达率在术后 1、2、3、4及 8周 ,高眼压组右眼与左眼、sham对照组右、左眼间比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1) ,同时发现视网膜中HSP2 7阳性表达随着眼压升高及高眼压持续时间延长逐渐增强。结论　内源性HSP2 7在青光眼视网膜神经节细胞中表达增强可能在青光眼视神经保护中具有重要作用。     

大鼠高眼压模型中热休克蛋白27抗体及视网膜神经节细胞凋亡的研究

背景 青光眼是一组以视网膜神经节细胞( RGCs)慢性丢失为特征的常见致盲性眼病.目前青光眼的发病机制尚不完全清楚,热休克蛋白27 (HSP27)抗体可能与青光眼视神经病变有关系. 目的 通过建立大鼠高眼压模型,检测血清中HSP27抗体的表达及RGCs的凋亡,了解HSP27抗体与眼压及RGCs凋亡的关系.方法 将51只Wistar大鼠按随机数字表法随机分为高眼压组34只和伪手术对照组17只,均取右眼为实验眼,左眼为对照眼.采用双极水下电凝器电凝高眼压组大鼠右眼巩膜表面3组静脉,建立高眼压动物模型.伪手术对照组大鼠右眼只剪开上方球结膜,不做电凝.分别于术后1、2、4、6、8周处死高眼压组大鼠6、6、6、8、8只,伪手术对照组大鼠3、3、3、4、4只.处死前测大鼠双眼眼压,并收集血清1 ml测定大鼠血清HSP27抗体.10只大鼠(2个组各时间点各1只)实验眼剥离视网膜,经匀浆后提取视网膜蛋白质用于Western blot分析.摘除剩余41只大鼠双侧眼球,制作石蜡切片.TUNEL法检测视网膜组织切片中RGCs的凋亡情况.结果 大鼠造模后3d,1、2、4、6、8周实验眼眼压较术前均明显增高,各时间点的总体比较差异有统计学意义( F=318.502,P＜0.01),但伪手术对照组手术前后眼压变化差异无统计学意义(F=2.076,P＞0.05).高眼压组大鼠实验眼视网膜HSP27蛋白水平与伪手术对照组大鼠实验眼比较均有升高.高眼压组大鼠术后1、2、4、6、8周血清中HSP27抗体各时间点总体比较差异有统计学意义(F=154.221,P＜0.01),随着造模时间的延长,血清HSP27抗体呈逐渐升高的趋势,而伪手术对照组手术前后HSP27抗体的变化差异无统计学意义( F=0.422,P＞0.05).高眼压组造模后实验眼不同时间点RGCs凋亡阳性细胞率比较差异有统计学意义(x2=856.12,P＜0.05).高眼压组不同时间点RGCs凋亡阳性细胞率均较伪手术对照组高(P＜0.05).结论 随着眼压的升高以及高眼压持续时间的延长,大鼠血清中的HSP27抗体水平逐渐升高,视网膜在高眼压状态下HSP27表达上调.逐渐升高的HSP27抗体水平与RGCs凋亡增加的趋势一致.     

热休克蛋白72在急性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞中的表达

目的检测热休克反应和硫酸锌腹腔内注射诱导热休克蛋白72(heat shock protein 72,HSP72)在急性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的表达及时间规律。方法以平衡盐溶液(barbitol buffer solu-tim,BSS)在前房内加压灌注制作大鼠急性高眼压模型;用热休克反应或硫酸锌腹腔内注射处理模型大鼠,在不同时间点处死大鼠,摘取模型眼,剥离视网膜,行Western blot分析。结果正常大鼠RGCs中无HSP72的表达。急性高眼压模型眼前房灌注BSS后6~36 h,RGCs内出现HSP72的微量表达,48 h后消失。热休克反应和硫酸锌腹腔内注射处理后,模型大鼠RGCs中均出现HSP72的表达,但HSP72的表达持续时间不同。热休克反应组,6 h出现HSP72的表达,以后逐渐增加,48 h达到最高峰,然后逐渐减弱,至反应后第8天消失;硫酸锌注射组,24 h后开始出现HSP72的表达,72 h达到最高峰,以后逐渐减弱,到第21天后消失。结论正常大鼠RGCs中无HSP72的表达;热休克反应和硫酸锌腹腔内注射均可以诱导急性高眼压模型大鼠RGCs中HSP72的表达。     

热休克蛋白72（HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞和视神经的保护作用

目的　探讨热休克蛋白72（heat shock protein 72,HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞（retinal ganglial cells,RGCs）和视神经的保护作用。方法　选取Wistar大鼠46只，采用随机数字表法将所有大鼠分为正常对照组（6只）和实验组（40只），实验组40只大鼠中8只不作处理（实验对照组），在制作青光眼模型后2 d，给予16只大鼠热休克反应处理（热休克反应组），16只大鼠硫酸锌腹腔注射（硫酸锌注射组）。观察及比较治疗前后各组大鼠眼压、RGCs中HSP72抗体含量、RGCs平均密度。结果　激光后3 d、7 d、14 d、28 d，各组大鼠右眼眼压均较激光前有所上升，且各组间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。正常对照组大鼠不同时间点HSP72抗体在RGCs中无表达，激光后3 d实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量缓慢上升，7 d、14 d达高峰，此后逐渐下降至接近正常水平。激光后，实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量显著高于正常对照组，且热休克反应组RGCs中HSP72抗体含量均高于实验对照组，低于硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。激光后3 d、7 d、14 d、28 d实验组各组大鼠RGCs平均密度均明显低于正常对照组，且热休克反应组RGCs平均密度显著高于实验对照组和硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　热休克蛋白反应可在青光眼模型大鼠RGCs中诱导HSP72的生成，且对青光眼性RGCs和视神经具有保护作用。     

大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞凋亡的研究

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡是造成青光眼视神经损害的主要原因.本研究建立大鼠青光眼模型,TUNEL法检测大鼠RGCs凋亡,探讨青光眼的发病机制.     

大鼠急性高眼压模型视网膜组织中HSP60的表达及功能

目的:探讨HSP60(热休克蛋白60)在大鼠急性青光眼模型视网膜组织中的表达及其与血清中相应抗体的关系。方法:将SD大鼠70只随机分为高眼压组60只,正常对照组10只。大鼠全身及表面麻醉后,将一盛有等渗的生理盐水的储容器相连的7号针头于3∶00位的角膜缘处刺入前房,提升储容器的高度,使眼内压达到110mmHg,但不超过150mmHg,观察大鼠眼前段变白,且视网膜色白,未见红色反光时即为视网膜缺血,缺血1h后再灌注,并于再灌注后2,6,12,24,72,168h将大鼠麻醉过量致死,处死前测眼压,抽血2mL,供酶联免疫吸附测定使用,分析视网膜组织内HSP60抗原产生的血清中相应抗体水平。并立即取出眼球,同时对鼠眼视网膜组织进行石蜡切片,采用免疫组化法检测视网膜组织中HSP60的表达及分布情况,并对检测结果进行统计学分析。结果:急性高眼压诱导的视网膜缺血/再灌注组眼压明显升高,视网膜组织中的HSP60阳性表达率在术后各时间点,高眼压组与正常对照组比较,差异有统计学意义(F=97.21,40.72,83.85,95.82,48.63及44.37,均P<0.01)。神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)中HSP60阳性表达随着眼压升高及高眼压持续时间延长逐渐增强,且视网膜神经纤维层中也出现较明显的HSP60阳性表达。结论:HSP60表达增强可能在急性高眼压所致的视神经病变中具有重要作用。     

热休克蛋白72对大鼠急性高眼压性视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的探讨热休克蛋白72(heat shock proteiu,11SP 72)对大鼠急性高眼压性视网膜神经节细胞(1GCs)损伤的保护作用.方法右眼前房内灌注平衡盐溶液制作大鼠急性高眼压性RGC损伤模型;用热休克反应或腹腔内注射硫酸锌诱导模型大鼠RGCs中HSP 72表达,观察HSP72表达以后,模型大鼠RGC密度的改变情况,并与术处理的模型大鼠RGC密度相比较.结果正常大鼠RGC密度为2 504±181个/mm2;急性高眼压模型大鼠RGC密度为2 015±111个/mm2.热休克反应组和硫酸锌注射组RGC密度分别为2 207±200个/mm2和2 262±155个/mm2,显著高于模型组(P热休克=0.036,P硫酸锌=0.019);IISP 72阴性对照组与模型组RGC密度差异无显著意义(P槲皮黄酮 热休克=0.260,P槲皮黄酮 硫酸锌=0.748).结论热休克反应和腹腔内硫酸锌注射在急性高眼压模型大鼠RGCs中诱导产生的HSP72;可能对急性高眼压性RGC损伤具有保护作用.     

下调热休克蛋白B8在视神经损伤中对小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察敲低热休克蛋白B8 （HspB8）对鼠视神经钳夹（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒（AAV) 2-小发夹HspB8 （shHspB8）-绿色荧光蛋白（GFP）。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组...     

慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞及视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β的表达变化

目的 观察慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞(retina ganglion cells,RGCs)和视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β[p-GSK3β(ser9)]的表达变化,探讨GSK3β是否在慢性高眼压RGCs及视神经退行性病变中发挥作用.方法 取健康SD大鼠30只,随机分为3组:模型对照组、慢性高眼压模型2周组、慢性高眼压模型4周组,每组10只.取大鼠右眼,采用巩膜上静脉结扎并烧灼法建立大鼠慢性高眼压模型.分别于造模后2周和4周取5只大鼠眼球行冰冻切片,尼氏染色观察RGCs数目,免疫荧光染色观察RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)的变化;各组取另外5只大鼠眼视网膜,Western blot检测p-GSK3β(ser9)及总-GSK3β的表达.结果 造模前3组大鼠右眼眼压差异无统计学意义(P=0.89);造模后3组间眼压差异有统计学意义(P＜0.01),慢性高眼压模型2周组和4周组眼压与模型对照组比较明显升高,分别升高了59.13％和26.93％,差异均有统计学意义(均为P＜O.01).视网膜尼氏染色RGCs计数发现模型对照组RGCs数为(149±12)个,慢性高眼压模型2周组和4周组RGCs数较模型对照组明显减少,分别为(120±10)个和(86±7)个,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);且4周组比2周组进一步减少(P＜0.01).慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)阳性着色,同模型对照组相比,其RGCs层及视神经中p-GSK3β(ser9)染色荧光减弱;4周组较模型对照组减弱更明显.与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中总-GSK3β的表达差异无统计学意义(F=0.24,P=0.79);而3组间p-GSK3β(ser9)表达差异有统计学意义(P＜0.01),与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)分别减少了19.89％和36.46％(均为P ＜0.05).慢性高眼压模型4周组比2周组视网膜中p-GSK3β(ser9)表达持续减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 慢性高眼压模型鼠RGCs数目减少,RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)表达减少,推测p-GSK3β(ser9)表达变化可能参与了慢性高眼压模型鼠RGCs及视神经退行性病变.     

青光眼动物模型中自噬与视网膜神经节细胞的关系

青光眼的主要病理特征是视网膜神经节细胞(RGCs)渐进性丢失,而其损伤机制尚未明确.自噬是溶酶体降解物质的过程,该过程消除了受损的细胞成分,包括细胞器和长寿蛋白,这对维持细胞内环境的稳定有着重要作用.最近的研究表明,自噬参与了青光眼发病的病理生理过程.本文总结了视神经损害模型、视网膜缺血-再灌注模型、高眼压模型等不同青光眼动物模型中自噬与RGCs的关系,发现在不同青光眼动物模型中,自噬既可促进RGCs存活,又可促进其死亡,而在相同动物模型中,自噬对RGCs的调节也发挥着双刃剑的作用.同时阐述了自噬与具有神经元保护作用的Sirt1之间的相互作用.     

Sensitized heat shock protein 27 induces retinal ganglion cells apoptosis in rat glaucoma model

AIM: To investigate the relationships between the changes of heat shock protein 27 antibody (anti-HSP27) in serum/cerebrospinal fluid (CSF), intraocular pressure (IOP), retinal ganglion cell (RGC) apoptosis in a rat glaucoma model and disclose the underlying pathogenesis of glaucoma. METHODS: A total of 115 Wistar rats were randomly divided into 4 groups. Group 1 was the ocular hypertension group by condensing 3 episcleral & limbal veins or episcleral area of right eye (HP group, n=25) and sham operation group with conjunctiva incision without coagulation (n=25). Group 2: HSP27 or dose-matched PBS was injected into the vitreous (V-HSP27 group, n=15; V-PBS group, n=15). Group 3: HSP27 and complete Freund’s adjuvant or dose-matched PBS was injected subcutaneously into the hind limb accompanied intraperitoneal injection of pertussis toxin [sensitized group (I-HSP27 group), n=15; I-PBS group, n=15)]. Group 4 was normal group without any treatment (n=5). IOPs of the rats were measured before, day 3, weeks 1, 2, 4, 6, and 8 after treatment. Paraffin-embedded sections were prepared for HE staining and RGCs apoptosis were detected by TUNEL. Anti-HSP27 level in serum and CSF were examined by ELISA. RESULTS: IOPs were elevated significantly in HP and V-HSP27, V-PBS groups (P<0.01) and positively related to anti-HSP27 levels in serum and CSFs. Anti-HSP27 levels in serum and CSF were elevated significantly in I-HSP27 group compared to other groups (P<0.05). However, the IOPs did not show any relationship with the high-level anti-HSP27 in serum and CSFs. RGC apoptosis were all elevated significantly in the HP, V-HSP27, V-PBS and I-HSP27 groups and also positively relative with anti-HSP27 level in serum and CSFs except that high-level of anti-HSP27 in the serum of I-HSP group. CONCLUSION: The increases of anti-HSP27 levels in serum and CSFs both promote IOP escalation and the increase of RGC apoptosis in retina when anti-HSP27 is at low level. The case of high-level anti-HSP27 is opposite and shows protective function in preventing IOP increase and RGC apoptosis.     

雷公藤甲素在慢性青光眼大鼠模型中对视网膜神经节细胞的保护

背景青光眼是一种以视神经损害为病理特点的常见致盲性眼病。目前,通过延缓或阻止病程的进展而保护视神经是青光眼研究的热点。目的研究中药雷公藤的有效提取成分雷公藤甲素对慢性青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法选用清洁级Wistar雌性大鼠80只,采用房水释放联合激光房角光凝法建立慢性青光眼大鼠模型。右眼为激光眼,左眼为对照眼。激光光凝前3d起每日雷公藤甲素组大鼠腹腔给予雷公藤甲素5μg／kg直至处死,生理盐水组以同样的方式给予等量生理盐水。于术前,术后1、3、5d,1周及此后每周用Tono—PenXL眼压计监测眼压。激光光凝术后1、2、4、8周制作大鼠眼球视网膜铺片并行Nissl染色,对RGCs进行定量检测。结果激光眼术后1d眼压较术前增高,术后1周达高峰,持续约3周,4周时眼压恢复正常;对照眼各时间点眼压值与术前相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。术后各时间点雷公藤甲素组激光眼与生理盐水组激光眼间眼压的差异无统计学意义（P〉0．05）。生理盐水组激光眼术后1周RGCs数量开始减少,术后4～8周RGCs存活数量明显下降;与生理盐水组激光眼相比,各时间点雷公藤甲素组激光眼RGCs数量明显增多,差异均有统计学意义（P〈0．05）。雷公藤甲素组激光眼与其对照眼相比,各时间点RGCs数目的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论雷公藤甲素能防止慢性青光眼大鼠模型的RGCs损伤,对RGCs具有保护作用,该作用并不依赖于眼压的下降,这可能为青光眼的治疗提出新思路。     

Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma

Elevation of intraocular pressure (IOP) is a major risk factor for neurodegeneration in glaucoma. Glial cells, which play an important role in normal functioning of retinal neurons, are well involved into retinal ganglion cell (RGC) degeneration in experimental glaucoma animal models generated by elevated IOP. In response to elevated IOP, mGluR I is first activated and Kir4.1 channels are subsequently inhibited, which leads to the activation of Müller cells. Müller cell activation is followed by a complex process, including proliferation, release of inflammatory and growth factors (gliosis). Gliosis is further regulated by several factors. Activated Müller cells contribute to RGC degeneration through generating glutamate receptor-mediated excitotoxicity, releasing cytotoxic factors and inducing microglia activation. Elevated IOP activates microglia, and following morphological and functional changes, these cells, as resident immune cells in the retina, show adaptive immune responses, including an enhanced release of pro-inflammatory factors (tumor neurosis factor-α, interleukins, etc.). These ATP and Toll-like receptor-mediated responses are further regulated by heat shock proteins, CD200R, chemokine receptors, and metabotropic purinergic receptors, may aggravate RGC loss. In the optic nerve head, astrogliosis is initiated and regulated by a complex reaction process, including purines, transmitters, chemokines, growth factors and cytokines, which contributes to RGC axon injury through releasing pro-inflammatory factors and changing extracellular matrix in glaucoma. The effects of activated glial cells on RGCs are further modified by the interplay among different types of glial cells. This review is concluded by presenting an in-depth discussion of possible research directions in this field in the future.     

腺相关病毒介导的脑源性神经营养因子对DBA／2J小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

背景神经营养因子的缺乏与青光眼的视神经损害密切相关。外源性神经营养因子的补充具有短暂的保护作用。腺相关病毒（AAV）介导的神经营养因子可在眼内长期表达,但是否对青光眼动物的视神经具有持久的保护作用有待研究。目的评估AAV介导的脑源性神经营养因子（BDNF）基因在DBA／2J小鼠眼内的表达及其对视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法健康清洁级DBA／2J小鼠10只从4月龄起,每月使用Tonolab眼压计测量眼压。6月龄时左眼玻璃体腔内注射AAV介导的BDNF和绿色荧光蛋白（GFP）基因（AAV—BDNF—GFP）1μ1,右眼注射等量的生理盐水作为对照。注射后3个月心脏灌流后取出视网膜,荧光显微镜下观察GFP在视网膜中的表达,免疫组织化学法计算存活的RGCs数目并进行比较。结果DBA／2J小鼠4月龄时AAV—BDNF—GFP眼眼压平均为11．90mmHg,对照眼眼压为11．40mmHg。实验眼与对照眼眼压5月龄时均开始升高,8月龄时达到高峰。从4月龄到9月龄,实验组和对照组眼压比较差异无统计学意义（t=-1．78～0．61,P=0．11—0．90）。玻璃体腔注射AAV—BDNF—GFP3月龄后视网膜可以观察到GFP阳性细胞,转染率为46．33％±8．08％。AAV—BDNF—GFP组实验眼的平均RGCs的密度为（3168．13±1319．33）mm^2,对照眼为（2024．81±796．38）mm^2,差异有统计学意义（t=2．75,P=0．02）。结论AAV介导的BDNF对DBA／2J小鼠RGCs有保护作用。     

青光眼疾病中视网膜胶质细胞的作用

青光眼是一种视网膜视神经的退行性病变,以视网膜神经节细胞(RGCs)的凋亡为基本病理基础,但其凋亡的具体机制尚未完全阐明.目前,大量在体及体外研究发现,视网膜胶质细胞,如Müller胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞与青光眼的发生和发展,特别是RGCs的损伤密切相关.胶质细胞上存在众多神经递质受体、离子通道、表面标志物及效应分子,同时也可释放活性因子,因此胶质细胞除了传统认为的具有对神经元的支持营养作用外,还积极参与神经元之间的信息传递过程.在青光眼条件下,胶质细胞可被激活并产生许多生理、生化及形态学改变,一方面可释放神经保护因子,启动神经保护程序;另一方面在胶质细胞过度激活时也会影响其正常生理功能或释放有害因子,加重视网膜神经元的损伤.这2种作用在青光眼中常常并存,但目前这些作用的潜在机制和相关信号通路尚不十分清楚,因而青光眼神经元损伤后胶质细胞是如何重建或进一步破坏神经元功能需要进行更多的研究.本文对视网膜Müller细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞的基本生理特征,以及在青光眼病理过程中各自的功能变化进行综述.