siRNA下调叉头框M1基因表达对大肠癌细胞化疗敏感性的影响

目的: 观察叉头转录因子M1(forkhead box protein M1,FoxM1)基因小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对大肠癌细胞化疗药物敏感性的影响,并探讨其可能机制。方法: 设计合成3个FoxM1 siRNA,转染人大肠癌SW620细胞后,采用定量PCR方法筛选下调FoxM1 mRNA效果最好的siRNA,然后以不同浓度（3.125 ,6.25 ,12.5 nmol/L）的该siRNA转染处理大肠癌细胞,用RPMI 1640代替FoxM1 siRNA作为空白对照组（Con A）;48 h后,各组细胞分别用伊立替康（Irinotecan,CPT 11,7.5 μmol/L）处理,以MTT法检测siRNA转染对各组细胞增殖及对伊立替康敏感性的影响;以蛋白质印迹方法检测Akt磷酸化情况。结果： MTT结果显示,空白对照组、siRNA 3.125 nmol/L组、siRNA 6.25 nmol/L组和siRNA 12.5 nmol/L组SW620细胞生长抑制率分别为18.36%,39.78%,58.18%,78.28%。统计学分析显示,抑制率呈浓度依赖性(r=0.775,P<0.05）。蛋白质印迹结果表明,siRNA转染组Akt磷酸化水平明显下调。结论： FoxM1 基因siRNA可提高大肠癌细胞化疗敏感性;下调Akt磷酸化水平是其重要机制之一。     

叉头框蛋白Q1在非小细胞肺癌的表达及其与预后关系

目的：研究人非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤组织中叉头框蛋白Q1（FOXQ1）的表达水平,探讨其与NSCLC患者的临床病理特征相关性,及其对患者预后的影响。方法选择天津市胸科医院2007年6月至2008年12月期间术后病理为NSCLC患者石蜡标本共84例。应用免疫组织化学染色SP法检测患者肿瘤组织中FOXQ1蛋白的表达水平。分析FOXQ1蛋白的表达与NSCLC患者临床病理参数、NSCLC患者生存时间的关系。结果FOXQ1在肿瘤组织中阳性表达率为91．7％（77／84）。FOXQ1蛋白阳性表达与NSCLC患者的病理类型、临床分期均密切相关（P＜0．05）。COX比例风险回归模型分析结果显示：病理分型、临床分期以及FOXQ1蛋白表达水平均是影响NSCLC预后的独立因素（P＜0．05）。结论FOXQ1蛋白在NSCLC患者肿瘤组织中高表达与患者预后呈负相关。     

叉头样转录因子3在肺恶性肿瘤中的作用

叉头样转录因子（Foxp3）是一个具有多种功能的转录因子,通常调控细胞生长发育,不但在肿瘤发生、发展中发挥作用,而且在肿瘤的治疗、预后评估中均起着相当重要的作用.Foxp3是通过调控调节性T细胞（Treg细胞）水平,抑制肿瘤微环境免疫功能,使肿瘤细胞逃避免疫监视,导致肿瘤的发生.抑制Foxp3表达,使机体发挥正常免疫功能,可达到抗肿瘤目的.本文就Foxp3在肺恶性肿瘤中的表达和肿瘤免疫中的作用机制以及免疫治疗中的作用作一综述.     

下调Foxp3基因表达对人调节性T细胞功能的影响

目的 利用RNA干扰技术下调Foxp3表达,观察其对人CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表型及功能的影响.方法 利用Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg,荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测转染效率,实时定量PCR和Western印迹分别鉴定Foxp3基因及Treg功能相关基因表达、Foxp3蛋白表达,细胞增殖实验检测Treg抑制功能,FACS测Treg表型标记,ELISA检测细胞因子表达.结果 Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg效率为68%,与对照组相比,转染后的细胞Foxp3基因下调了61.4%(P<0.01),Foxp3蛋白表达较低,Treg功能相关基因和主要表型标记也较对照组有改变,差异有统计学意义.功能试验提示无论是在异种还是同种抗原刺激的淋巴细胞反应中,Foxp3 siRNA转染的Treg与对照组相比,对效应性T细胞的抑制作用较弱(异种抗原组83%比48%,P<0.05;同种抗原组65%比28%,P<0.01),且主要抑制性和效应性细胞因子的表达下降,差异有统计学意义.结论 Foxp3是人天然Treg 维持其抑制性功能的核心细胞内标志.

Abstract：

Objective To employ the technology of interfering RNA (RNAi) to identify the role of Foxp3 in the in vitro suppressive effect of human regulatory T cell (Treg) on effector T cells. MethodsExpanded human Treg were transfected with siRNA targeting Foxp3 genes. The transfection efficiency, the level of corresponding gene and its protein expression were measured by fluorescent microscopy, fluorescence-activated cell sorting (FACS), real-time PCR and Western blot respectively. The phenotypes of Treg were analyzed by FACS. The siRNA transfected Treg was then co-cultured with porcine PBMC or human PBMC-stimulated autologous CD4+CD25- T cells. Their proliferations were examined by WST-1. Treg and autologous CD4+CD25- T cell-related suppressive cytokines were assessed by ELISA. ResultsA 68% transfection efficiency in expanded Treg was achieved for Foxp3 siRNA. Real-time PCR revealed a 61.4% mRNA knockdown induced by siRNA targeting Foxp3 genes in Treg versus the control (P<0.01). Some Treg-associated surface markers were significantly altered versus the control. And the production of suppressive cytokines was lowered. These changes were correlated with the diminished Treg activity in suppressing the proliferation of effector CD4+CD25-T cells. There was 83% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in xeno-immune response (P<0.05);and 65% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in allo-immune response (P<0.01). Conclusion Foxp3 is a key intracellular marker for maintaining the phenotypes and functions of Treg.     

叉头框转录因子M1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及意义

 目的探讨叉头框转录因子M1（FoxM1 ）在人类甲状腺乳头状癌组织中的表达及其意义。方法利用实时荧光定量PCR、Western blot检测20例甲状腺乳头状癌组织及相应的20例癌旁正常组织和20例甲状腺腺瘤组织中FoxM1 mRNA和蛋白的表达水平并进行统计学分析。结果FoxM1 mRNA及蛋白表达在甲状腺乳头状癌组织中显著高于癌旁正常甲状腺组织及甲状腺腺瘤组织（均P <0.01）,癌旁正常甲状腺组织和甲状腺腺瘤组织比较差异无统计学意义（P >0.05）,甲状腺乳头状癌有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组（P <0.01）,包膜侵犯组高于包膜无侵犯组（P <0.01）。FoxM1 mRNA及蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及TNM分期均无关（P >0.05）。结论FoxM1 mRNA及蛋白的异常表达可能与甲状腺乳头状癌的发生发展、淋巴结转移、包膜侵犯有关,有望成为甲状腺乳头状癌诊治中的一个新的标志物。     

RNAi沉默PRL-1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAinterference,RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶1(phosphatase of regenerating liv-er cell-1,PRL-1)基因对肺癌细胞侵袭力的影响。方法:应用PRL-1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理肺癌A549细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹检测PRL-1基因mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果:与对照组比较,siR-NA转染组PRL-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。体外试验发现,PRL-1siRNA可有效抑制肺癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P<0.05,P<0.05)。结论:PRL-1基因在肺癌侵袭中起着重要的作用,采用PRL-1 siRNA转染可抑制肺癌细胞侵袭。     

针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用

目的:构建针对HER2/neu的RNA干涉载体,观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法:设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链,退火互补成双链,克隆至pSUPER质粒载体,转化DH5α菌株,提取质粒,转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPC-A-1,RT-PCR检测HER2/neu的mRNA表达,Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达,FCM分析细胞周期变化,MTT法观察细胞生长. 结果:肺腺癌细胞系SPC-A-1存在HER2/neu过表达;成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPER-siHER2;瞬时转染SPC-A-1细胞,HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低;G1期细胞较亲代增加9.9%;肿瘤细胞增殖速度减慢(P＜0.05). 结论:成功构建了HER2/neu RNA干涉载体,转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPC-A-1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达,阻滞转染细胞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段.     

肥胖相关基因与叉头转录因子在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏中的表达

目的 研究肥胖相关基因(FTO)与叉头转录因子O1(FoxO1)蛋白在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏中的表达水平.方法 通过饲喂高能量和高脂肪的大鼠饲料制备非酒精性脂肪肝动物模型,然后采集大鼠的血液和肝脏组织,测定其肝脏指数和血液生化指标,包括三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(AST)、天冬氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL);对大鼠进行肝脏病理检测;采用免疫组织化学法测定FTO蛋白和FoxO1蛋白在大鼠肝脏中的表达水平.结果8周后,模型组大鼠的肝脏质量、体质量和肝脏指数3项指标均高于对照组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠的AST、ALT、LDL、ALP、TG和TC均高于对照组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠的HDL低于对照组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠肝小叶部分产生脂肪变性、炎症,对照组大鼠则没有;模型组大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝脏中的表达积分高于对照组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05).结论FTO与FoxO1一起相互作用,可能扰乱正常的能量和脂肪代谢.     

非小细胞肺癌中半乳凝素1的表达及其临床意义

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中半乳凝素 1(Gal-1)mRNA及蛋白的表达及临床意义.方法 采用RT-PCR、蛋白质印迹技术分别检测35例NSCLC患者的癌组织、癌旁组织及远处正常肺组织(距癌组织边缘大于5 cm)中Gal-1 mRNA及蛋白表达情况.结果 NSCLC患者癌组织、癌旁组织以及有淋巴结转移的NSCLC患者正常肺组织中,Gal-1 mRNA的表达水平均明显高于无淋巴结转移的NSCLC患者正常肺组织(P<0.05); NSCLC患者癌组织、癌旁组织以及有淋巴结转移的NSCLC患者正常肺组织中,Gal-1蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移的NSCLC患者正常肺组织(P<0.     

抑癌基因LKB1对肺癌细胞血管内皮生长因子的表达调控

目的：了解抑癌基因LKBl对肺癌细胞A549血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的调控作用。方法：应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区，构建LKBl的真核表达载体并以脂质体法转染A549细胞，G418筛选稳定表达细胞株；RT-PCR及Western印迹法检测LKBl、SPl和VEGF在A549细胞中的表达变化；siRNA技术干扰转录因子SPl的表达，RT-PCR及Western印迹法检测SPl和VEGF的表达变化。结果：外源性LKBl在A549细胞中稳定表达；LKBl蛋白下调SPl和VEGF的表达；SPl可被特异性siRNA分子有效抑制，siRNA介导的SPl沉默伴随VEGF表达下调。结论：LKBl可能通过负调控转录因子SPl的表达从而调控VEGF的表达。     

靶向Id-1基因的RNA干扰对人矽肺癌细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Id-1基因表达后对矽肺癌细胞株增殖能力的影响。方法针对Id-1基因mRNA靶向设计合成短发夹RNA,构建重组pGFU6/neo质粒,重组质粒转染矽肺癌YTLMC-90细胞株。反转录-聚合酶链式反应检测转染后Id-1基因的转录;免疫印迹法检测Id-1,核转录因子NF-κB/p50、NF-κB/p65,Bcl-2,Bax,环氧合酶-2,c-Myc基因,血管内皮细胞生长因子,增殖细胞核抗原,β-actin基因的表达;流式细胞术检测细胞周期的变化;~3H-胸腺嘧啶核苷掺入法、四氮唑蓝法和克隆形成实验检测细胞的增殖活力。结果重组质粒经酶切和测序鉴定,证明靶基因序列正确,质粒构建成功;反转录-聚合酶链式反应和免疫印迹法检测结果表明,矽肺癌细胞转染重组质粒后Id-1基因mRNA转录和蛋白合成都明显下降,Bcl-2、环氧合酶-2、c-Myc、增殖细胞核抗原、血管内皮细胞生长因子等与增殖相关基因表达量下降;细胞周期被阻滞在G_0/G_1期,S期细胞明显减少;细胞活力降低,增殖受到抑制。结论构建的重组质粒能靶向沉默Id-1基因,并抑制YTLMC-90细胞株的增殖能力,因此Id-1基因可以作为人矽沉着病并发肺癌基因治疗的候选靶点。     

RNA干扰抑制CD59对非小细胞肺癌GLC-P细胞株增殖的影响

目的运用RNAi技术抑制CD59基因的表达,观察其对非小细胞肺癌细胞株GLC-P增值、凋亡的影响。方法合成可抑
制CD59基因的片段,并运用RNA干扰技术,构建重组质粒,通过脂质体转染法将重组质粒转染至非小细胞肺癌细胞株GLC-P,
并筛选出稳定表达细胞后,采用PCR、MTT、ELISA 法检测该稳定表达细胞株的增值、凋亡所受到的影响。结果干扰后的
GLC-P细胞株中CD59 mRNA表达量较未干扰组显著降低（P<0.05）,同时MTT、ELISA实验检测显示肺癌GLC-P细胞增殖能
力降低,可诱导肺癌细胞的凋亡。结论肺癌患者肿瘤细胞中存在CD59高表达,抑制CD59基因表达的同时可抑制GLC-P细
胞的增殖能力并诱导细胞凋亡,为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了新靶点、新思路。
     

RNAi抑制卵巢癌SKOV3细胞MMP-24基因表达及对细胞侵袭的影响

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默MMP-24基因表达,研究其对人卵巢上皮癌SKOV3细胞侵袭力的影响.方法 设计合成2条特异性针对MMP-24基因的siRNA,转染至SKOV3中,采用RT-PCR和Western blotting检测MMP-24mRNA和蛋白表达情况,细胞侵袭实验观察转染后细胞侵袭能力的变化.结果 转染siRNA后,卵巢癌细胞MMP-24mRNA表达受抑制,蛋白表达降低,细胞侵袭力减弱.结论 RNAi沉默MMP-24基因可影响卵巢癌细胞的侵袭,有可能成为治疗卵巢癌的新途径.     

Osteopontin knockdown suppresses non-small cell lung cancer cell invasion and metastasis

Background Osteopontin (OPN) was identified as one of the leading genes that promote the metastasis of malignant tumor.However,the mechanism by which OPN mediates metastasis in non-small cell lung canc...     

RhoC基因表达与前列腺癌细胞系侵袭行为相关性的体外研究

目的 研究RhoC基因在不同转移潜能前列腺癌细胞系中的表达及其与前列腺癌侵袭行为的相关性.方法 利用逆转录聚合酶链反应、Western印记方法检测前列腺癌不转移亚系(PC-3M-284)和高转移亚系(PC-3M-1E8)细胞中RhoC mRNA和蛋白表达水平;构建RhoC基因真核表达载体转染前列腺癌不转移亚系PC-3M-2B4;利用Matrigel胶穿膜侵袭实验检测转染后细胞的体外侵袭能力、划痕修复实验检测运动迁移能力、组织化学染色检测微丝骨架结构的变化、明胶酶谱分析基质金属蛋白酶(MMP)活性变化,并利用Western印记检测Akt信号传导通路磷酸化水平变化.结果 RhoC在两种不同转移能力前列腺癌细胞系中不同程度表达,在高转移亚系中高表达,不转移亚系中低表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).基因转染过表达RhoC后前列腺癌细胞的体外侵袭能力明显增强,正义转染组(125.21±10.43)与其相应空载体组(53.77±8.56)、反义组(46.22±8.12)和未转染对照组(57.68±7.25)相比,穿膜细胞数明显增多(P＜0.01);运动迁移能力明显增强,正义转染组16 h划痕修复率(62.38±2.36)明显高于转染空载体组(32.23±2.43)、反义组(29.47±1.86)和未转染对照组(31.88±2.67)(P＜0.01);组织化学染色显示正义转染组细胞内肌动蛋白多聚体减少,微丝骨架杂乱、模糊;此外,RhoC基因正义转染组细胞MMP-2活性上调,p-Akt水平升高.结论 RhoC基因过表达促进前列腺癌细胞的体外侵袭能力,并与前列腺癌细胞系转移潜能正相关,有望成为阻断前列腺癌转移的治疗新靶点.     

伴有同肺叶内转移的N0-1M0非小细胞肺癌的预后分析

目的 分析同肺叶内转移的N0-1M0非小细胞肺癌的预后,探讨将叶内转移的非小细胞肺癌的T4分期进行下调的合理性.方法 通过回顾性分析,评估2001年1月至2007年9月中山大学肿瘤防治中心胸外科收治的手术治疗的同肺叶内转移的非小细胞肺癌患者的临床资料.入组患者的术后病理分期为N0-1M0期,评价这些患者的预后情况.统计分析用SPSS 10.0完成,生存分析用Kaplan-Meier法.结果 共有46例患者符合入组条件,纳入生存分析.总的5年生存率为29.2%,中位生存期为53.0个月.腺鳞癌的中位生存期为24个月,而其他病理类型的中位生存期为48个月,差异有统计学意义(P=0.003).全肺切除者中位生存期为24个月,非全肺切除者中位生存期为60个月,差异有统计学意义(P=0.023).结论 将伴有同肺叶内转移的非小细胞肺癌的T4分期进行下调是合理的;同肺叶内转移的N0-1M0的非小细胞肺癌是有手术指征的,但全肺切除需要慎重考虑.腺鳞癌患者的预后较差,但需要更大样本的研究来证实.     

非小细胞肺癌外周血中CK19mRNA与LUNXmRNA检测的临床意义

目的:检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血细胞角蛋白19(CK19)及肺特异性蛋白X(LUNX)的表达,探讨其对检测NSCLC微转移的可行性。方法:应用RT-PCR技术检测30例NSCLC患者及15例健康人外周血CK19mRNA及LUNXmRNA的表达。结果:NSCLC患者外周血中CK19mRNA及LUNXmRNA的阳性表达率分别为30%及13.3%,而对照组外周血中均无表达,外周血CK19mRNA及LUNXmRNA的表达与临床分期密切相关,与病理类型无关。结论:CK19及LUNX均可作为检测NSCLC患者外周血微转移较为敏感的分子标志物,联合检测有助于提高检测结果的阳性率。     

RNA干扰对VEGF在人卵巢癌细胞中表达及细胞增殖的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人卵巢癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和对卵巢癌细胞增殖的影响.方法::采用脂质体介导的方法将抗VEGF小发夹状双链RNA真核基因表达载体转染到人卵巢癌细胞(HO-8910)中,用G418 筛选获得阳性克隆.用Western印迹法、RT-PCR检测VEGF基因在卵巢癌细胞中的表达;通过MTT及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响. 结果:转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的HO-8910细胞中VEGF表达量明显减少;HO-8910细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少.结论:VEGF小发夹RNA质粒载体可显著抑制HO-8910细胞中的VEGF基因的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖,该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据.     

血清VEGF水平在非小细胞肺癌综合评价中的作用

目的 通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血清血管内皮细胞生长因子(sVEGF),探讨sVEGF 与NSCLC患者之间的关系及临床意义。方法 用酶联免疫吸附法(ELISA)检测69例NSCLC患者和20例健康正常人的sVEGF水平。结果 NSCLC患者的sVEGF水平(156.3±17.2)pg/mL 显著高于健康正常人(46.6±19.3)pg/mL(P=0.0000)。sVEGF与患者的年龄、性别、肿瘤大小、初复治组间差异无统计学意义(P＞0.05)。鳞癌患者sVEGF 表达明显高于腺癌(P=0.0297),有远处转移NSCLC患者的sVEGF含量显著高于无远处转移的(P=0.000?0)。sVEGF水平与外周血白细胞数、中性粒细胞数和血小板数密切相关（r=0.524,0.634及0.728）。放疗前、结束时和放疗后SD+PD组sVEGF水平分别高于CR+PR组。结论 检测NSCLC患者的sVEGF水平,对评估肿瘤负荷、复发转移、疗效均为一项有意义的指标。     

长链非编码RNA BANCR对非小细胞肺癌增殖和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA BANCR在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及细胞系中的表达水平,以及BANCR对NSCLC细胞增殖和侵袭的影响?方法:用定量PCR技术检测NSCLC组织及细胞系中BANCR的表达水平;通过转染pcDNA-BANCR上调BANCR的表达水平,并通过qPCR检测转染效率?用Transwell实验检测上调BANCR的水平对SPC-A1细胞和A549细胞增殖和侵袭能力的影响,Western blot检测这2种细胞中上调BANCR的水平对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平的影响?结果:相比正常肺组织及细胞,在NSCLC组织和细胞中BANCR的表达出现显著下调?MTT实验显示,上调BANCR的表达能降低SPCA1细胞和A549细胞的增殖和侵袭能力?BANCR过表达能通过上调E-cadherin表达并下调Vimentin表达,影响EMT?结论:BANCR可通过影响EMT,抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭?