下调FoxM1基因表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向FoxM1基因的小分子干扰RNA(siRNA)下调宫颈癌Hela、C33A及Siha等细胞系FoxM1基因表达后细胞侵袭和迁移能力的改变,寻找新的宫颈癌治疗靶点。方法:设计靶向FoxM1基因小分子干扰RNA(siFoxM1)并分别转染宫颈癌细胞系Hela、C33A和Siha,实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测siFoxM1对细胞内源性FoxM1表达的影响;采用Transwell小室试验检测细胞迁移和侵袭能力改变。结果:1转染siFoxM1可特异高效地下调宫颈癌细胞FoxM1mRNA水平和蛋白表达水平,Hela、C33A和Siha细胞FoxMl mRNA分别下降92.29%,87.65%和95.82%;2细胞迁移试验显示3株细胞的平均OD值较对照组分别降低40.61%,49.65%和50.87%(P<0.05)。细胞侵袭试验显示3株细胞的平均穿膜细胞数较对照组分别降低86.67%,71.77%和72.48%(P<0.01)。结论:FoxM1基因表达下调可显著降低多株宫颈癌细胞侵袭和迁移能力,有可能成为有效的宫颈癌治疗靶点。     

siRNA靶向沉默HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭的影响

目的:探讨质粒介导RNA干扰抑制HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭能力的影响。方法:利用基因工程方法构建HIF-1α的干扰表达载体,并将其转染至肺腺癌A549细胞;分别用RT-PCR方法、Western blot方法检测细胞转染前后HIF-1α以及MMP-2的mRNA及蛋白表达的变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测转染前后肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:转染后肺腺癌A549细胞中HIF-1α和MMP-2的mRNA表达分别下降86%和64%(P<0.05)。转染后细胞蛋白表达明显下降。转染前后穿膜细胞数分别为(135.2±13.2)、(63.7±10.5),差异具有统计学意义(P<0.05)。转染前后划痕宽度分别为(0.48±0.14)、(1.04±0.15)mm,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi可有效抑制HIF-1α的表达,同时可结合MMP-2启动子下调MMP-2基因和蛋白的表达,降低肺癌A549细胞的转移和侵袭能力。     

5，7-二甲氧基黄酮下调FoxMl基因表达对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响

目的：探讨5,7二甲氧基黄酮（5,7-DMF）对胰腺癌细胞上皮-间充质转化的影响及分子机制。方法：用不同浓度DMF处理人胰腺癌Panc-1细胞,利用划痕法检测5,7-DMF干预后Panc-1细胞侵袭转移能力变化;用Western blot检测5,7-DMF干预后FoxM1蛋白表达情况;FoxM1siRNA转染人胰腺癌Panc-1细胞后,用Western blot进而检测 EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子N-cadherin蛋白水平的表达变化。结果：5,7-DMF以浓度依赖方式显著抑制Panc-1细胞侵袭转移能力。5,7-DMF干预胰腺癌细胞后显著下调FoxM1表达水平;FoxM1 siRNA转染胰腺癌细胞,EMT相关分子E-cadherin表达升高,而N-cadherin表达降低,且与对照组相比均有统计学意义。结论：5,7二甲氧基黄酮可逆转胰腺癌细胞上皮-间充质转化,可能通过下调FoxM1水平是其重要机制之一,但其内在的分子机制尚需进一步探讨。     

siRNA干扰人宫颈癌基因(HCCR)的表达对胰腺癌PANC1细胞增殖?凋亡和侵袭的影响

目的:建立稳定转染人宫颈癌癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,探讨siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:通过脂质体转染法将含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测PANC1细胞中HCCR的表达,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化;MTT比色法检测siRNA干扰后对PANC1细胞增殖能力的影响:Transwell侵袭实验观察siRNA干扰后对PANC1细胞侵袭能力的影响.结果:Western blot证实siRNA稳转组的PANC1细胞株和空载体稳转组比较HCCR蛋白表达水平下调,稳转细胞株建立成功.siRNA稳转组p53蛋白表达下降.siRNA稳转组的S期细胞数目减少而G0/G1期细胞数目增加,细胞凋亡增加.MTT结果显示siRNA稳转组1和稳转组2细胞吸光度分别为空载体组细胞的0.65倍和0.68倍,细胞增殖能力下降.Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组细胞和空载体组细胞穿膜数分别为24.4±9.9和49.1±15.4(P＜0.01),稳转组细胞侵袭能力下降.结论:siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡.     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

hnRNP B1 siRNA对肺腺癌细胞A549 p53表达的影响

目的 探讨核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1调节肺腺癌细胞A549抑癌基因p53表达的作用.方法 采用前期研究已构建并通过体外实验证实具有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的小干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体(重组质粒A和D)转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组,对照组为转染空质粒的A549细胞和未转染任何质粒的A549细胞.各组细胞均用10 μmol/L顺铂作用24 h收集细胞.实时荧光定量RT-PCR检测p53 mRNA的表达,Western blot检测P53及磷酸化P53蛋白表达的变化.结果 各组细胞p53 mRNA和蛋白表达量无明显差异,说明hnRNP B1特异性siRNA对A549细胞p53基因mRNA和蛋白表达无影响.转染hnRNP B1 siRNA细胞磷酸化P53蛋白表达率分别为0.87±0.06、0.75±0.06,与空质粒转染组(0.30±0.08) 和未转染组(0.21±0.04)相比明显增高(P<0.01).结论 hnRNP B1 siRNA可上调肺腺癌细胞A549 P53活性,参与肺癌的发生发展.     

FoxM1通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞5-8F增殖、迁移的影响

目的 探讨FoxM1对鼻咽癌细胞5-8F恶性生物学行为的影响及其可能机制.方法 将化学合成的靶向FoxM1的siRNA转染鼻咽癌细胞5-8F(FoxM1-siRNA组),并设立空白对照组、阴性对照组,采用RT-PCR及Western blot检测FoxM1表达变化.采用MTT法、FCM法、Transwell法分别检测下调FoxM1表达对细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响.Western blot检测下调FoxM1表达后β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化.结果 转染FoxM1-siRNA的5-8F细胞FoxM1 mRNA和蛋白表达水平降低(P＜0.05).下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞增殖(P＜0.05),FoxM1-siRNA组的凋亡率为(22.68±0.67)％,较阴性对照组[(1 1.74±1.36)％]和空白对照组[(10.94±1.52)％]显著增加(P＜0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期.FoxM1-siRNA组细胞穿膜数(100.00±10.97)明显低于阴性对照组(246.00±6.66)和空白对照组(233.70±12.41),细胞迁移能力降低(P＜0.05).下调FoxM1的表达可抑制β-catenin细胞核表达,抑制C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9总蛋白表达(P＜0.001).结论 FoxM1表达下调抑制鼻咽癌细胞5-8F的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移能力,使细胞周期阻滞于G0/G1期.其机制可能是通过抑制Wnt通路关键蛋白β-catenin细胞核表达从而抑制Wnt 通路活性实现的.     

AEG-1抑制miR-137对非小细胞肺癌增殖调控作用

目的 探讨AEG-1在miR-137抑制非小细胞肺癌(NSCLC)增殖中的作用及机制。方法收集2013年2月~2014年5月在本院手术治疗的65例NSCLC患者肿瘤标本,提取RNA,qRT-PCR检测NSCLC组织、A549、H460及16HBE细胞中miR-137与AEG-1的表达,统计分析NSCLC组织中miR-137与胶质细胞上调基因1(AEG-1)表达的相关性;将A549细胞根据不同转染试剂分成4组:转染miR-137 mimics及空载体组,转染miR-137 mimics及AEG-1表达载体组,转染miR-137 inhibitor及siRNA无关序列组,转染miR-137 inhibitor及AEG-1 siRNA组。用Lipofectamine 2000进行转染,生长曲线实验检测转染后细胞增殖情况。结果在NSCLC组织中miR-137与AEG-1的表达呈负相关;miR-137表达高的NSCLC细胞中AEG-1表达降低;共同转染miR-137 mimics与AEG-1过表达载体的A549细胞在48 h的细胞数高于对照组,而共同转染miR-137 inhibitor与AEG-1 siRNA的A549细胞在48 h、72 h的细胞数低于对照组。结论miR-137与AEG-1在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关;AEG-1逆转miR-137对NSCLC细胞增殖的作用。     

靶向EGFR基因的siRNA表达载体构建及其生物学效应的研究

目的构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体(pSi-EGFR),并观察其抑制人肺腺癌细胞株A549中EGFR基因表达的效果及生物学效应.方法利用Lipofectamine2000将构建的pSi-EGFR载体转入A549细胞中,应用实时定量荧光PCR、免疫荧光和流式细胞仪检测EGFR基因mRNA和蛋白水平的表达,并采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTF)、集落形成实验观察细胞生长变化.结果pSi-EGFR可显著抑制A549细胞中EGFR基因的表达;转染pSi-EGFR细胞生长抑制率为67.8%,集落形成抑制率为59.4%.结论pSi-EGFR载体能够在A549细胞中引发RNA干扰(RNAi)效应下调EGFR基因表达来抑制细胞增殖.     

小干扰RNA抑制高迁移率族蛋白B1基因表达对肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)基因表达对肺癌细胞L9981增殖和侵袭能力的影响.方法 L9981细胞分3组,其中2组分别转染靶向HMGB1基因的siRNA(HMGB1-siRNA组)和无关序列siRNA(无关siRNA组),1组为空白对照组.转染后72 h,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平;细胞活力计数仪测定各组细胞活力.分别在转染后24、48、72和96 h应用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞生存状态.应用Boyden小室实验检测转染后72 h各组细胞的体外侵袭力.结果 HMGB1-siRNA组HMGB1mRNA相对表达量(1.0±0.0)明显低于无关siRNA组(12.8±1.3,P<0.05)和空白对照组(12.1± 1.0,P<0.05),HMGB1蛋白表达水平也明显受到抑制;细胞活力(44.7%±1.7%)明显低于无关siRNA组(73.7%±2.1%,P<0.01)和空白对照组(77.3%±1.9%,P<0.01).MTT测定显示转染后不同时间HMGB1-siRNA组L9981细胞生长均受到明显抑制.Boyden小室实验显示HMGB1-siRNA组穿膜细胞数(个/高倍视野,18.3±2.2)明显少于无关siRNA组(127.7±9.3,P<0.01)和空白对照组(132.3±10.7,P<0.01).结论 利用siRNA技术抑制HMGB1基因表达可有效抑制肺癌细胞的体外增殖和侵袭.     

阿霉素对不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞株生长的影响

目的:研究阿霉素对体外培养不同C-erbB-2表达水平肺腺癌细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:采用集落形成实验检测阿霉素对人肺腺癌细胞体外增殖能力的影响,采用SABC法检测阿霉素对体外培养人肺腺癌细胞系C-erbB-2表达水平的影响,采用流式细胞术检测阿霉素对体外培养肺腺癌细胞生长周期的影响。结果:阿霉素可显著抑制3株人肺腺癌细胞的生长,并可使SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系C-erbB-2的表达下降,在SPC-A-1和LTEP-a-2肺腺癌细胞系,G2-M期百分率明显升高,而在A549肺腺癌细胞系则可见明显的凋亡峰。结论:阿霉素抑制肺腺癌细胞株SPC-A-1和LTEP-a-2的生长机制可能与降低C-erbB-2表达引起肺腺癌细胞G2阻滞有关,其抑制肺腺癌细胞株A549生长则可能与诱导细胞凋亡有关。     

PTTG ESP1在A549 SPC-A-1细胞株S G2/M期的表达

目的探讨PTTG(pituitary tumortransforming gene)、ESP1(estradiol-stimulated protein 1)在A549、SPC-A-1细胞S、G/M期的表达.方法用双胸苷同步化法同步化A549、SPC-A-1细胞及MRC-5细胞,分别收集S、G2/M期总RNA,做Realtime PCR.结果PTTG在A549细胞和SPC-A-1细胞的S期表达比G2/M期表达高,在MRC-5细胞的在S、G2/M期中P1TG均无表达;ESP1在A549细胞与SPC-A-1细胞及MRC-5细胞的S期表达均比G2/M期表达低.结论PTTG在MRC-5的S、G2/M期都无表达,在A549、SPC-A-1的S期比G2/M期表达增高,提示肿瘤细胞的染色体非整倍体与PTTG的表达增高有关;ESP1在MRC-5和A549、SPC-A-1的S期比G2/M期表达低,说明细胞中姐妹染色体的分离主要依靠于ESP1在G2/M期被激活,而导致姐妹染色体的分离.     

DFOG对A549细胞生长及FoxM1表达的影响

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4′-二-正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人肺癌细胞生长作用及机制.方法:用不同浓度DFOG处理体外培养A549细胞后,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布;平皿集落形成法测定细胞生长;Western blot分析FoxM1蛋白表达.结果:DFOG处理24 h导致A549细胞系G2期细...     

FoxM1基因表达与甲状腺乳头状癌TPC-1细胞活性及侵袭性关系的研究

目的 研究FoxM1基因表达水平对甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）细胞活性和侵袭性有无影响,探讨FoxM1与PTC疾病的相关性.方法 分别用hFoxM1-RNA干扰和硫链丝菌素处理PTC TPC-1细胞,观察处理后的癌细胞与未经处理的癌细胞在细胞活性、侵袭能力、迁移能力方面的变化,并使用Real-time PCR检测各组细胞中FoxM1基因的表达水平,观察硫链丝菌素对FoxM1基因表达水平的影响.结果 在TPC-1细胞中,使用hFoxM 1-RNA干扰和硫链丝菌素处理均能使细胞活性明显下降（P＜0.05）,用2种方法处理后,细胞侵袭能力分别降低了约29.2％及38.63％,细胞迁移能力分别降低了约46.0％及47.5％,且PCR结果表明,hFoxM1-RNA干扰和硫链丝菌素处理均明显抑制TPC-1细胞中FoxM1基因mRNA的表达,分别抑制55％及38％.结论 FoxM1能促进PTC细胞的侵袭转移,其作为潜在的肿瘤标志物值得关注,而硫链丝菌素能抑制肿瘤细胞中FoxM1的表达.     

BAMBI在非小细胞肺癌细胞系中的分布及表达

目的 观察BAMBI在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系中的表达分布情况,并探讨其表达与NSCLC病理分型及侵袭潜能之间的关系.方法 利用免疫荧光技术检测人肺腺癌细胞系A549以及人肺巨细胞癌具有不同侵袭潜能的亚系BE1、LH7中BAMBI的分布,采用逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测3种细胞中BAMBI的mRNA及蛋白表达.结果 BAMBI mRNA在A549细胞系中的表达(0.574±0.035)显著低于BE1细胞系(0.731±0.051)及LH7细胞系(0.734±0.049,P值均<0.001),后两者间的差异无统计学意义(P=0.216).A549细胞系中BAMBI蛋白相对含量(0.769±0.103)显著低于BE1细胞系(0.963±0.061)及LH7细胞系(0.957±0.048,P值均<0.001),后两者间的差异无统计学意义(P=0.096).BAMBI在A549细胞膜上的染色强度较弱,且呈现颗粒状不均一性;在BE1、LH7细胞膜上的染色较强,连续且均匀一致.结论 BAMBI在NSCLC中的表达定位于细胞膜上以及靠近细胞膜的细胞质中,其在肺巨细胞癌细胞中的表达高于肺腺癌细胞,且其表达高低可能与肺巨细胞癌细胞的侵袭潜能无关.     

RNA干扰沉默IGF-I R表达对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的:评价RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(IGF-I R)表达的阻断效应,和IGF-I R基因沉默后细胞增殖、凋亡等生物学特性及肿瘤细胞对化疗药物敏感性的改变.方珐:应用U6启动子,介导DNA模板转录生成短发夹样RNA(shRNA),并转染人肺癌A549细胞株,从而产生IGF-I R特异性小干扰RNA(siRNA),经RT-PCR和Western blot检测IGF-I R表达的改变;联合应用化疗药物顺铂(DDP),通过MTT法和流式细胞技术等,观察细胞生长、细胞周期、细胞凋亡及DDP半数致死量(IC50)的变化.结果:IGF-I R表达水平明显下降(抑制率高达89.8%),肿瘤细胞增殖能力明显减弱,细胞滞留于G0期的比例上升;DDP对肿瘤细胞24 h、48 h、72 h的IC50均明显减少,IGF-I R siRNAl组DDP作用72h的IC50为0.92 mg/L,明显低于control-siRNA组的3.77 mg/L,0.5 mg/L DDP联合IGF-I R siRNAl作用48 h后,A549细胞的生长抑制率达32.1%,明显高于control-siRNA组的18.9%,细胞凋亡率从27.8%上升至44.2%.结论:运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-I R的表达,使细胞增殖能力减弱,化疗敏感性增加.     

microRNA-224通过调节Bim影响人非小细胞肺癌的增殖与凋亡

目的:研究microRNA-224(miR-224)在人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及对NSCLC细胞增殖能力和凋亡的影响?方法:采用荧光实时定量PCR(qPCR)检测20对NSCLC组织与癌旁组织中miR-224的表达量,以及miR-224在NSCLC细胞A549与正常肺支气管上皮细胞中的表达量,并计算差值;转染anti-miR-224至A549细胞,qPCR检测anti-miR-224的转染效率;四甲基偶氮唑盐(MTT)实验及克隆形成实验检测miR-224对A549细胞增殖能力的影响,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡;荧光素酶报告实验证实miR-224与靶基因Bim的结合;qPCR及Western blot检测转染anti-miR-224后A549细胞中Bim的表达量?结果:与癌旁正常组织相比,miR-224在NSCLC组织及细胞中均显著高表达(P < 0.05);抑制miR-224能够显著抑制A549细胞的增殖能力并促进凋亡,并促进了Bim的表达?结论:miR-224在NSCLC中呈高表达,miR-224能够通过调控Bim抑制A549细胞的增殖能力并诱导凋亡?     

干扰CD151基因表达对裸鼠肺腺癌A549细胞肺转移的实验

目的 探讨RNA干扰抑制CD151基因表达对肺腺癌A549细胞肺转移的影响.方法 将构建的RNA干扰抑制CD151基因表达的稳转细胞A549-sh RNA、A549-sh NC、A549-Blank 3组细胞通过尾静脉注射入裸鼠BALB/c-nu, 30 d后解剖, 通过肉眼和HE染色后观察肺转移情况.结果 A549-sh RNA、A549-sh NC、A549-Blank各组裸鼠肺转移率及肺组织上的转移病灶数依次为:62.5% (5/8) 与 (4.7±1.5) , 100% (7/7) 与 (9.3±0.8) , 75% (6/8) 与 (8.2±1.5) .转移病灶数, A549-sh RNA与A549-sh NC (P=0.000) , A549-sh RNA与A549-Blank (P=0.006) 比较, 差异有统计学意义.结论 RNA干扰抑制CD151基因表达能减少A549细胞裸鼠的肺转移.CD151可能成为抑制NSCLC侵袭和转移的潜在的治疗靶点之一.     

FHL1对肺腺癌细胞株A549生物学特性的影响

 目的 研究FHL1的表达对人肺腺癌细胞株A549生物学特征的影响。方法 以FHL1 mRNA及shRNA慢病毒载体转染肺腺癌细胞株A549,并采用Western blot及RT-PCR法筛选检测稳定过表达FHL1肺腺癌细胞株模型及低表达细胞株模型;运用CCK-8实验、Transwell实验、流式细胞仪、细胞集落形成实验等方法对其增殖、侵袭、凋亡及锚定非依赖性生长生物学特性进行检测评估。结果 FHL1稳定过表达及低表达组的Western blot及RT-PCR法检测显示病毒转染效果可靠稳定;CCK-8实验提示低表达组的细胞增殖情况明显高于过表达组及空白组(P=0.002 2);流式细胞仪检测提示过表达组的细胞总体凋亡率为50.48%,明显高于两个低表达组(16.41%、20.12%)及空白对照组(25.90%),差异有统计学意义(P<0.001);Transwell实验提示过表达组细胞表现出的侵袭性明显低于低表达组及空白组差异有统计学意义(P<0.001);成集落实验显示过表达组细胞株形成的集落数为28.7±6.0,明显少于两个低表达组(157.0±6.4、150.7±9.5),差异有统计学意义(P<0.001)。结论 稳定过表达FHL1肺腺癌细胞株A549模型及低表达模型构建成功。FHL1的表达对于肺腺癌细胞株A549的增殖、侵袭及转移均有抑制作用,并能够诱导其加速凋亡。