FADD—DN基因转染对氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的影响

目的 探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法 将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组、转染对照组和非转染组，转染组细胞与绿色荧光蛋白（GFP）质粒cDNA、含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转染，转染对照组细胞与GFP质粒cD-NA、空载体质粒pcDNA3共转染，非转染组细胞没有进行转染，转染后24h分别对各组细胞进行氦氖激光照射（100mW/cm^2照射30min），1次/d，连续照射3d，然后采用TUNEL技术检测细胞凋亡。结果 转染组、转染对照组与非转染组细胞凋亡率分别为9.27%，15.73%和12.87%，转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组（q=4.55,P&;lt;0.01）和非转染组（q=4.14,P&;lt;0.05）。结论 FADD-DN基因转染能减少氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡，FADD可能是氦氖激光激活死亡信号途径的基本元件之一。     

氦氖激光诱导培养瘢痕成纤维细胞的凋亡

目的：氦氖激光重复照射能诱导瘢痕成纤维细胞凋亡，进一步探讨氦氖激光功率密度与培养瘢痕成纤维细胞凋亡之间的关系。方法：实验于1999—02／10在创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。以不同功率密度氦氖激光(10，50，100和150mw／cm^2)照射培养人瘢痕成纤维细胞，照射时间分别为10，30min，1次／d，连续照射3d后24h，采用TUNEL技术、琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡，锥虫蓝染色法检测细胞坏死。结果：10，50mW／cm^2照射细胞10min或30min，无凋亡细胞出现；100mW／cm^2照射细胞10，30min时凋亡率分别为(7．20&;#177;0．43)％，(12．73&;#177;0．75)％；150mW／cm^2照射细胞10，30min时凋亡率为(14．47&;#177;0．68)％，(16．27&;#177;0．96)％，分别大于同期100mW／cm^2照射(t=0．36，P&;lt;0．01，t=0．24，P&;lt;0．001)；DNA裂解片段分析示100，150mW／cm^2照射30min时可见特征性梯带存在；所有功率密度照射培养细胞10min或30min，都无坏死细胞出现。结论：以100mW／cm^2或150mW／cm^2功率密度氦氖激光重复照射能诱导培养瘢痕成纤维细胞凋亡。就诱导细胞凋亡而言，激光的功率密度比能量密度更重要。     

氦氖激光诱导培养瘢痕成纤维细胞的凋亡

目的:氦氖激光重复照射能诱导瘢痕成纤维细胞凋亡,进一步探讨氦氖激光功率密度与培养瘢痕成纤维细胞凋亡之间的关系。方法:实验于1999-02/10在创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。以不同功率密度氦氖激光(10,50,100和150mW/cm)照射培养人2瘢痕成纤维细胞,照射时间分别为10,30min,1次/d,连续照射3d后24h,采用TUNEL技术、琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡,锥虫蓝染色法检测细胞坏死。结果:10,50mW/cm照射细胞10min或30min,无凋亡细胞出现;2100mW/cm照射细胞10,30min时凋亡率分别为7.20±0.43)%,2((12.73±0.75)%;150mW/cm照射细胞10,30min时凋亡率为2(14.47±0.68)%,(16.27±0.96)%,分别大于同期100mW/cm照2射(t=0.36,P<0.01,t=0.24,P<0.001);DNA裂解片段分析示100,150mW/cm照射30min时可见特征性梯带存在;所有功率密度2照射培养细胞10min或30min,都无坏死细胞出现。结论:以100mW/cm或150mW/cm功率密度氦氖激光重复照射能22诱导培养瘢痕成纤维细胞凋亡。就诱导细胞凋亡而言,激光的功率密度比能量密度更重要。     

氦-氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制

目的探讨氦-氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组、转染对照组和非转染组,转染组细胞与绿色荧光蛋白(GFP)质粒cDNA、含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转染,转染对照组细胞与GFP质粒cDNA、空载体质粒pcDNA3共转染,非转染组细胞没有进行转染,转染后24h分别对各组细胞进行氦-氖激光照射(100mW/cm2照射30min),1次/d,连续照射3d,然后采用TUNEL技术检测细胞凋亡。结果转染组、转染对照组与非转染组细胞凋亡率分别为9.27%、15.73%和12.87%,转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组(q=4.55,P<0.01)和非转染组(q=4.14,P<0.05)。结论FADD-DN基因转染能减少氦-氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡,Fas相关死亡域蛋白(FADD)可能是氦-氖激光激活死亡信号途径的基本元件之一。     

氦—氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制

目的：探讨氦－氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法：将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组，转染对照组和非转染,志染组细胞与绿色荧光蛋白（GFP）质粒cDNA，含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转,志染对照组细胞与GFP质粒cDNA，空载体质粒pcDNA3共转染，非转染组细胞没有进行转染，转染后24h分别对各组细胞进行氦－氖激光照射（100mW/cm^2照射30min)，1次／d，连续照射3d，然而采用TUNEL技术检测细胞凋亡，结果：转染组，转染对照组与非转染组细胞亡率分别为9．27％，15．73％和12．87％，转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组（q=4.55,P&;lt;0.01)和非转染组（q＝4.14,P&;lt;0.05)。结论：FADD－DN基因转染能减少氦－氖激光诱导的瘢痕的瘢瘢痕成纤维细胞凋亡，Fas相关死亡域蛋白（FADD）可能是 －激光激活死亡信号途径的基本元件之一。     

氦氖激光重复照射对瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响

目的从蛋白质水平探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的机制。方法以632.8nm波长、100mW/cm2功率密度氦氖激光照射培养瘢痕成纤维细胞,1次/d,30min/次,连续照射3d,然后分别采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪测定bcl-2,Fas,ICE蛋白的细胞分布与表达。结果在培养增生性瘢痕成纤维细胞有多种凋亡相关基因表达蛋白分布,氦氖激光照射后,Fas,ICE表达增加,bcl-2表达降低。结论氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡与Fas,bcl-2,ICE表达蛋白有关。     

RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡

目的：利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶，观察细胞增殖和凋亡的变化。方法：实验于2004-12／2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。实验选用10-12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只，以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组，选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组，共4组，各6只。消化法培养大鼠心脏成纤维细胞，设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体，western blot法测量黏附斑激酶的沉默效率，四唑盐比色法检测细胞增殖，DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡，流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化。结果：Wistar大鼠24只，全部进入结果分析。①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功，转染细胞后，Western blot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率最高，为72．1％，其余分别为66．2％和55．3％。（2）Pavu6＋27一黏附斑激酶2转染组A。值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组（0．179&;#177;0．017，0．30&;#177;0．002，0．296&;#177;0．006，0．28l&;#177;0．007；t=17．802，16．436，14．993，P〈0．01）：凋亡率较其余各组则明显升高【（22．28&;#177;2．13）％，（472&;#177;1．67）%，（636&;#177;92）％，（8．19&;#177;1．33）％；t=-19．05，-17．31，-15．16，P〈0．01]。（3）Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显，与正常对照组和空质粒转染组比较，差异十分显著（2．15&;#177;058，1．01&;#177;0．04，1．12&;#177;0．04；t=-4．79，-4．318，P〈0．01）；与阴性对照组比较，差异显著（1．19&;#177;0．31,t=-3．59，P〈0．05）。④Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升（1．62&;#177;0．15，1．04&;#177;0．03，1．09&;#177;0．01，1．23&;#177;0．04；t=-9．39，-8．701，-6．338，P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达，可诱导心脏成纤维细胞凋亡，抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段。     

氦氖激光重复照射对培养瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 :从蛋白质水平探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的机制。方法 :以波长 6 32 .8nm、功率密度10 0mW /cm2 的氦氖激光照射培养瘢痕成纤维细胞 ,每日 1次 ,每次 30min ,连续照射 3天 ,然后分别采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪测定Bcl- 2、Bax、Fas、ICE、p5 3、c -myc蛋白的细胞分布与表达。 结果 :在培养增生性瘢痕成纤维细胞有多种凋亡相关基因表达蛋白分布 ,氦氖激光照射后 ,Fas、ICE表达增加 ,Bcl- 2表达降低 ,Bax、p5 3、c -myc的表达无变化。结论 :氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡与Fas、Bcl- 2、ICE表达蛋白有关     

氦氖激光重复照射对瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 从蛋白质水平探讨氯氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的机制。方法 以632．8nm波长、100mW／cm^2功率密度氦氖激光照射培养瘢痕成纤维细胞，1次／d，30min／次，连续照射3d，然后分别采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪测定bcl—2，Fas，ICE蛋白的细胞分布与表达。结果 在培养增生性瘢痕成纤维细胞有多种凋亡相关基因表达蛋白分布，氯氖激光照射后，Fas，ICE表达增加，bcl—2表达降低。结论 氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡与Fas，bcl—2，ICE表达蛋白有关。     

RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡

目的:利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶,观察细胞增殖和凋亡的变化。方法:实验于2004-12/2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。实验选用10～12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只,以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组,选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组,共4组,各6只。消化法培养大鼠心脏成纤维细胞,设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体,westernblot法测量黏附斑激酶的沉默效率,四唑盐比色法检测细胞增殖,DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡,流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化。结果:Wistar大鼠24只,全部进入结果分析。①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功,转染细胞后,Westernblot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率最高,为72.1%,其余分别为66.2%和55.3%。②Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组A490值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组(0.179±0.017,0.30±0.002,0.296±0.006,0.281±0.007;t=17.802,16.436,14.993,P<0.01);凋亡率较其余各组则明显升高犤(22.28±2.13)%,(4.72±1.67)%,(6.36±0.92)%,(8.19±1.33)%;t=-19.05,-17.31,-15.16,P<0.01犦。③Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显,与正常对照组和空质粒转染组比较,差异十分显著(2.15±058,1.01±0.04,1.12±0.04;t=-4.79,-4.318,P<0.01);与阴性对照组比较,差异显著(1.19±0.31,t=-3.59,P<0.05)。④Pavu6 27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升(1.62±0.15,1.04±0.03,1.09±0.01,1.23±0.04;t=-9.39,-8.701,-6.338,P<0.05)。结论:通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达,可诱导心脏成纤维细胞凋亡,抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段。     

A型肉毒毒素引起人增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡

背景：A型肉毒毒素临床上可以治疗增生性瘢痕,体外细胞培养研究发现可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。目的：观察A型肉毒毒素对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用,以及对人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。方法：通过消化法分离培养出人增生性瘢痕成纤维细胞,分别用不同浓度的A型肉毒毒素对细胞的生长增殖过程进行干预,通过MTT染色,于酶联免疫检测仪570nm测定吸光度来研究细胞生长增殖情况,计算抑制率。通过Hoechst33342及PI染色检测人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡隋况,并计算凋亡率。结果与结论：人增生性瘢痕成纤维细胞生长过程中呈梭形,细胞生长旺盛,细胞融合成单层,细胞排列成高度一致性。经A型肉毒毒素处理后,细胞增殖速度明显减慢,细胞数量减少,细胞排列方向散乱。MTT染色后吸光度减弱,随A型肉毒毒素浓度增加,吸光度明显减弱,与对照细胞比较,差异有显著性意义（P〈0．05）,半数抑制率出现在0．4IU/L。在荧光显微镜下,人增生性瘢痕成纤维细胞经Hoechst33342和PI染色后细胞核呈现蓝色,细胞核为光滑的圆形或椭圆形外观。A型肉毒毒素干预后细胞核致密浓缩,染色不均匀,折光性增强,核膜皱缩,部分细胞核碎裂,出现碎块,有凋亡小体出现。随着A型肉毒毒素浓度的增加细胞凋亡率逐渐增高,与对照细胞比较差异有显著性意义（P〈0．05）,半数凋亡率在0．4IU／L。说明A型肉毒毒素可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,其主要通过引起细胞凋亡的途径来抑制成纤维细胞的增殖。     

人参皂苷Rg3对人成纤维细胞增殖和凋亡影响的实验研究

目的探讨人参皂苷Rg3对人成纤维细胞增殖及凋亡的影响。方法自瘢痕疙瘩患者手术切取的瘢痕组织分离、培养得到成纤维细胞。收集处于指数生长期的成纤维细胞接种于96孔板,加入GS-Rg3,终浓度为25、50、100、200μg/ml,对照组加入等量的培养液,放入37℃、5%CO2、孵箱内分别培养24、48、72 h。用MTT法计算抑制率。应用流式细胞术进行测定,记录细胞周期各时相以及AP区亚峰细胞百分率。结果 GS-Rg3对体外成纤维细胞的抑制率随浓度和时间的增加而增强,最大抑制率为92.8%,最佳抑制浓度为100μg/ml。结论 GS-Rg3对人成纤维细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导其凋亡。     

P27基因转染对瘢痕成纤维细胞超微结构的影响

目的：观察P27基因转染对体外培养增生性瘢痕成纤维细胞超微结梅的影响，探讨P27基因抑制瘢痕的作用。 方法：实验于2001-06／2002-01在第四军医大学烧伤科实验室、第四军医大学电镜中心完成。pcDNA—p273真核表达质粒由第一作者构建，应用基因转染技术将所构建的pcDNA3-p27载体转染成纤维细胞，培养的增生性瘢痕成纤维细胞分为空白对照组（即未经转染的增生性瘢痕成纤维细胞）、转pcDNA3空载体组、转pcDNA3-P27组。获得稳定的P27表达后，用透射电镜观察成纤维细胞内细胞器形态和数量的变化。 结果：①空白对照组成纤维细胞核大而呈圆形，核仁明显，胞浆内具有较丰富的粗面内质网，较发达的高尔基复合体，较多的线粒体、微丝、微管，细胞表面微绒毛及突起较多。②转pcDNA3空载体组粗面内质网、线粒体较丰富。⑨转pcDNA3-P27组细胞胞浆内粗面内质网、线粒体、微丝、微管明显减少，大部分细胞出现染色体边聚，粗面内质网上的核糖体明显减少，部分细胞呈现凋亡，大部分细胞呈典型的生长抑制像。④P27明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的合成功能。 结论：P27可能通过抑制成纤维细胞的细胞合成、增殖功能来抑制瘢痕形成。     

P27基因转染对瘢痕成纤维细胞超微结构的影响

目的:观察P27基因转染对体外培养增生性瘢痕成纤维细胞超微结构的影响,探讨P27基因抑制瘢痕的作用。方法:实验于2001-06/2002-01在第四军医大学烧伤科实验室、第四军医大学电镜中心完成。pcDNA-p273真核表达质粒由第一作者构建,应用基因转染技术将所构建的pcDNA3-p27载体转染成纤维细胞,培养的增生性瘢痕成纤维细胞分为空白对照组(即未经转染的增生性瘢痕成纤维细胞)、转pcDNA3空载体组、转pcDNA3-P27组。获得稳定的P27表达后,用透射电镜观察成纤维细胞内细胞器形态和数量的变化。结果:①空白对照组成纤维细胞核大而呈圆形,核仁明显,胞浆内具有较丰富的粗面内质网,较发达的高尔基复合体,较多的线粒体、微丝、微管,细胞表面微绒毛及突起较多。②转pcDNA3空载体组粗面内质网、线粒体较丰富。③转pcDNA3-P27组细胞胞浆内粗面内质网、线粒体、微丝、微管明显减少,大部分细胞出现染色体边聚,粗面内质网上的核糖体明显减少,部分细胞呈现凋亡,大部分细胞呈典型的生长抑制像。④P27明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的合成功能。结论:P27可能通过抑制成纤维细胞的细胞合成、增殖功能来抑制瘢痕形成。     

不同能量密度氦-氖激光照射对培养瘢痕成纤维细胞生长的影响

目的探讨氦-氖激光能量密度与培养瘢痕成纤维细胞生长的关系。方法以30、60、90、180和270J/cm2能量密度氦-氖激光(功率密度100mW/cm2),分别照射培养的人增生性瘢痕成纤维细胞1、3和5次,1次/d,然后采用台盼蓝染色法进行细胞计数。结果30J/cm2照射1次后细胞总数大于非照射组(P<0.001);90和180J/cm2照射3次,60、90和180J/cm2照射5次后细胞总数均少于同期非照射组(P<0.05),270J/cm2照射3、5次后细胞总数明显少于非照射组(P<0.001)。结论氦-氖激光对培养瘢痕成纤维细胞生长的抑制效应与能量密度、照射次数有关。     

nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响

目的研究nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1转染Tca8113细胞,分为Tca8113-Ad-nm23-H1组(转染pAdEasy-nm23-H1)、Tca8113-Ad组(转染空载体pAdEasy)和Tca8113组(未转染)。采用RT-PCR检测nm23-H1基因在细胞中的表达,噻唑蓝比色法检测转染前、后细胞体外增殖能力的变化,流式细胞术分析转染前、后细胞周期及凋亡的改变,采用Transwell小室和冲刷实验观察细胞侵袭、黏附、趋化运动能力的变化,克隆形成实验观察转染前、后细胞克隆形成能力。结果与Tca8113-Ad组和Tca8113组比较,Tca8113-Ad-nm23-H1组细胞体外增殖能力、细胞侵袭、黏附、趋化运动能力、克隆形成率及细胞S期比例下降(P<0.05);细胞G2/M期比例及凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 nm23-H1基因转染后对人舌癌Tca8113细胞的增殖能力、侵袭转移能力均有明显抑制作用;nm23-H1基因可明显抑制人舌癌Tca8113细胞G2期向M期过渡,同时促进癌细胞凋亡。     

微小RNA-126转染对内皮祖细胞体外生成血管能力的影响

目的研究微小RNA-126（mir-126）对内皮祖细胞（EPCs）血管新生的调节能力,探索促进EPCs新生血管的新方法。方法实验分为3组,每组20只大鼠：mir-126高表达组,无效序列转染组,无转染对照组。提取大鼠骨髓中单个核细胞（MNCs）,经体外诱导培养得到EPCs,使用细胞免疫荧光方法对细胞标记抗原及转染成功率进行鉴定。通过研究EPCs在基质胶中形成的管腔样结构的长度,以及离体环境下的迁移能力,判定各组内皮祖细胞的体外血管生成能力。结果转染mir-126组的内皮祖细胞较无效序列转染组和无转染对照组血管形成长度更长,分别为（1.52±0.16）mm、（1.19±0.14）mm vs（1.16±0.11）mm（P〈0.01）,迁移细胞数量更多,（121.83±11.86）个/视野、（91.33±6.25）个/视野vs（95.33±9.56）个/视野（均P〈0.01）。结论 mir-126可以增加内皮祖细胞的体外血管生成能力。