赖型钩体重组质粒pDJH2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为本重疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别一ＰＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化为大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达，结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ，ｐＤＪｒＢ能在大肠杆菌中一致，免疫印迹在６８ｋｄ处分别有印迹，用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强和株攻击，表现出免疫保护作用本实验结     

钩体017株基因库pDJH_2与L．alstoni重组DNA探针同源性及pDJH_2在大肠杆菌中表达产物的分析

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ＿２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。结果显示：该重组ＤＮＡ探针与ｐＤＪＨ＿２１．９ｋｂ插入片段同源；使用ＩＰＴＧ诱导重组质粒ｐＤＪＨ＿２后，其在大肠杆菌中表达了６８ｋｄ产物。经蛋白酶Ｋ消化、免疫印迹及斑点一酶联免疫吸附试验，提示此６８ｋｂ产物是蛋内质抗原；用该６８ｋｂ蛋白质抗原主动免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，可抵抗强毒力赖型钩体０１７株的攻击，表现出对小鼠的免疫保护性，从而为赖型钩体０１７株基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。此赖型０１７株钩体重组ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠杆茵中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。     

应用重组DNA探针检测不同毒力钩端螺旋体

应用质粒载体ｐＵＣ１８构建赖型钩端螺旋体０１７株的基因库。筛选出重组质粒ｐＤＪ６和ｐＤＪ８，插入片段分别是１．９ｋｂ和２．２ｋｂ。地高辛随机引物标记１．９ｋｂ片段制备探针，对５个血清型６株钩体ＤＮＡ进行杂交。结果显示，重组探针与致病钩体ＤＮＡ出现明显杂交信号，与非致病钩体，人白细胞ＤＮＡ及大肠杆菌ＪＭ１０３株ＤＮＡ杂交信号不明显。此特异性重组探针可作为鉴定、识别致病性钩体和进行钩体属、种分类的一种手段。     

钩体017株基因库pDJH2与L.alstoni重组DNA探针同源性及pDJH…

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。此赖型０１７株钩体重ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠菌中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经ＨｈａⅠ和ＡｌｕⅠ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲⅠ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲⅠ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲⅠ臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，建成含２．１×１０６重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出一个强阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆入ｐＵＣ１８质粒，获重组质粒，ｐＤＬ１２１。ＥｃｏＲⅠ酶切证实该重组质粒含有１ｋｂ的外源插入片段。ｐＤＬ１２１经ＩＰＴＧ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现２３ｋｄ特异条带。免疫印迹表明该蛋白带可被抗赖型钩体兔血清识别。     

卡介苗基因组的克隆

以质粒ｐＧＣ１９为载体克隆了卡介苗（即卡介菌，ＢＣＧ）ＤＮＡ。Ｓａｕ３Ａ１部分酶解ＢＣＧ ＤＮＡ，通过琼脂糖电泳分离２￣９ｋｂＤＮＡ片段。ＢａｍＨ１酶切质粒ｐＵＣ１９，碱性磷酸酶去磷酸化，２￣９ｋｂＤＮＡ片段与ｐＵＣ１９载体用Ｔ４连接酶连接转化大肠杆菌ＨＢ１０１，在含氨苄青霉素（Ａｍｐ）、５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷的ＬＢ平板上获得Ａｍｐ白色转化子。随机挑选１２个转化子快速提取重组子     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。     

人子宫颈粘液抗菌多肽的分离

用５％乙酸提取人子宫颈粘液可溶物，经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现，子宫颈粘液酸溶性提取物有两条主带对致病性大肠杆菌２５９２２株和金葡球菌２５９２３株有强抗菌活性，并分别命名为Ｈｃｐ－１和Ｈｃｐ－２。经Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，Ｈｃｐ－１分子量为６．７ｋｄ、１０ｋｄ和１５．４ｋｄ，Ｈｃｐ－２分子量为４．４ｋｄ、６．７ｋｄ、９ｋｄ和１５．４ｋｄ，均为多肽混合物。实验结果提示子宫颈粘膜能合成一类抗菌多肽，在子宫颈抗菌机理中发挥重要作用。     

赖型钩端螺旋体重组DNApCX7的特异性鉴定和限制性内切酶谱分析

本实验将赖型钩端螺旋体（简称钩体）ＤＮＡ基因库的克隆ｐＣＸ７制备成￣（３２）Ｐ－重组ＤＮＡ探针，对８个不同血清群的１７株问号状钩体、双曲钩体ＰａｔｏｃⅠ株以及细螺旋体３０５５株ＤＮＡ进行打点杂交；同时用１５种ＤＮＡ片断进行限制性内切酶谱分析。结果表明，该重组ＤＮＡ具有问号状钩体种（Ｓｐｅｃｉｅｓ）特异性，但与不同问号状钩体之间的同源性程度有差别；限制性内切酶谱分析发现ｐＣＸ７重组ＤＮＡ片段长约１．７ｋｂ，具有１个Ｂｇ１Ⅱ识别位点和３个ＢｓｔＢ１识别位点。     

针对问号钩体赖型外膜的抗原分析

作者采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术,对黄疸出血群赖型017株和601株、七日热群七日热型156株、澳洲群澳洲型620株以及塞马伦群帕托克型Patoc Ⅰ株等5株钩体外膜进行分析。检测到具有免疫保护作用和抑制钩体粘附作用的单克隆抗体E_4B_7D_5能特异地识别赖型017株和601株钩体外膜的34.5kd和39.5kd两条蛋白带,而同其余3株钩体外膜蛋白无反应。由此提示该两条蛋白带可能为钩体外膜保护性抗原。     

问号赖型钩体内鞭毛基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌的 …

为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，利用聚合酶链反应扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经ＳａｌＩ、ＣｌａＩ双酶切消化后定向克隆于ＰＴ７－７表达载体上。     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的…

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经Ｈｈａ Ｉ和Ａｌｕ Ｉ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲ Ｉ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲＩ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲ１臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０，建成含２．１×１０＾４重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出中阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆     

问号赖型钩体重组质粒rpDJt表达蛋白P68免疫原性的研究

为构建一种新型钩体重组亚单位疫苗,顺号本ｒｐＤＪｔ基因的蛋白表达物Ｐ６８免疫动物,对其免疫原性进行研究。结果显示,在体外,Ｐ６８能与其特异性抗血清及赖型钩体死菌苗抗血清呈明显高效价Ａｇ－Ａｂ反应,在体内,能激起明显的Ｔ淋巴细胞转化,ＴＨ细胞活化,ＩＬ－２,ＩＬ－６活性增加。提示：ｒｐＤＪｔ表达蛋白Ｐ６８能激起机体强有力的Ｔ－Ｂ细胞同性特异性体液免疫反应,是致病性强毒力钩体重组亚单位疫苗好的候选抗     

保护性MbE_4B_7G_5对问号状钩体疏水外膜蛋白OmpL_(39)的免疫印迹分析

选用具有高效价、特异性的黄疸出血群保护性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）Ｅ４Ｂ７Ｇ５，用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ，对ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（ＴＸ－１１４）抽提的６株问号状钩体（０１７、６０１、６０３、６０９、６２０、２４５株）的疏水外膜蛋白进行分析鉴定。结果表明，提纯的０１７、６０１、６０３、６０９株问号状钩体３９ｋｄ疏水外膜蛋白（ＯＭＰ）有明显的免疫反应，而６２０、２４５株此带区无明显的免疫识别。这一结果提示：用ＭｂＥ４Ｂ７Ｇ５筛选问号状钩体保护性抗原，分离、纯化３９ｋｄ的疏水外膜蛋白（ＯｍｐＬ３９）在构建钩体基因工程疫苗中有重要的研究价值。     

赖型017株钩体疏水外膜蛋白及其免疫特征的研究

采用低浓度非离子型去污剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（ＴＸ－１１４）后提和分离问号状钩端螺旋体（钩体）黄疸出血群赖型０１７株（０１７），选择性地将钩体外膜蛋白分离为ＴＸ－１１４疏水相和亲水相两个部分。疏水相外膜蛋白含５条主要蛋白区带，其分子量分别为６６ｋｄ、３９ｋｄ、３５ｋｄ、２７ｋｄ和６ｋｄ，，ａｄｋｈｗｃｙ ３９ｋｄ外膜蛋白区带可特异地分别被抗全０１７血清，抗０１７外膜血清和抗０１７保护性单克隆抗体     

保护性Mb E4B7G5对问号状钩体疏水外膜蛋白OmPL39的免疫…

选用具有高效价、特异性的黄疸出血群保护性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）Ｅ４Ｂ７Ｇ５，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，对Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１４４（ＴＸ－１４４）抽提的６株问号状钩体（０１７、６０１、６０３、６０９株）的疏水外膜蛋白进行分析鉴定。结果表明，提纯的０１７、６０１、６０３、６０９株问号状钩体３９ｋｇ疏水外膜蛋白（ＯＭＰ）有明显的免疫反应，而６２０、２４５株此带区无明显的免疫识别。这一结果提示：用     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫？…

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８例的免疫保护作用，采用随机、以盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质     

四株钩端螺旋体外膜单克隆抗体的建立,鉴定及对外膜蛋白抗原...

Four McAbs (1A7E7, 2F9D4, 2G3H5, 1A7H12) against outer membrane antigens of L. interrogans serovar Lai strain 017 were produced by hybridoma technique. McAb 1A7E7 was identified to be IgG2a, the rest IgG1 by immunodiffusion. Outer membrane antigens of three pathogenic leptospiral strains (017, 601, 156) and two non-pathogenic leptospiral strains (Patoc I, 3055) were analysed by SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting with McAbs. It was found that McAb 1A7E7 recognized specifically the 42kd antigenic band of strain 017; McAb 2F9D4 the 42kd antigenic bands of strain 017, 601, 156, and McAbs 2G3H5 and 1A7H12 the 31 kd antigenic bands of 017, 601, 156. Further study of antigenic properties possessed by pathogenic leptospira may provide some new clues to look for specific diagnostic and protective antigens.     

钩端螺旋体澳洲群体特异性McAb的建立,鉴定及群特异性...

Spleen cells of BALB/c mice immunized with whole Leptospira interrogans serogroup Australis serovar australis strain 620 were fused with myeloma cells line SP2/0. Specificities of four McAbs determined by MAT. 2E1 McAb (IgG3) reacted with 11 serovars, of the Australis serogroup, but did not react with 22 representative serovars of L. interrogans in 20 serogroups, L. biflexa strain patoc I and Leptonema illini strain 3055. 2E1 McAb showed serogroup specificity for Australis by agglutination and the other 3 McAbs showed partial serogroup specificity. We compared the outer envelope (OE) protein profiles of serovar australis strain 620 with those of two pathogenic L. interrogans serovar lai strain 601 and serovar hebdomadis strain 156 by SDS-PAGE. 63kd protein profile was only found in the OE of strain 620, and the quantity of 42kd protein of strain 620 was greater than that of strain 601 and 156. The immunoblotting revealed that 2E1 McAb reacted with a 34kd band in the OE preparation of serovar australis strain 620, but did not react with that of other two L. interrogans. 2E1 McAb also did not react with OE of non-pathogenic leptospires. It was suggested that 34kd protein might contain the antigenic determinants which were shared by leptospires of Australis serogroup.