一个新的Ⅰ型咪唑啉受体可变剪接体的克隆、鉴定及亚细胞分布

目的克隆Ⅰ型咪唑啉受体（I1R,Nischarin）新的可变剪接体,并对其进行表达特征和亚细胞定位研究,探索其表达与I1R的差异,从而为解释I1R药理学作用多样性奠定基础。方法在本课题组前期研究基础上设计引物,通过RT-PCR从大鼠肝组织中克隆新的可变剪接体,将其克隆到pcDNA3.1、pEGFP-N1和PCMV-myc3个真核表达载体中,并通过细胞转染探索其在293T细胞中的分布,应用Western印迹测定其在真核细胞中表达蛋白的相对分子质量特征。结果成功克隆获得一个新的I1R可变剪接体（命名为I1R-ISO-472）,编码472个氨基酸,与GenBank中序列号AK036043.1的新基因的序列完全一致。生物信息学分析表明,该基因染色体定位于14号染色体14B,含有磷酯酰肌醇结合位点（PX_domainsuperfamily）与亮氨酸富集重复（LRR-RIsuperfamily）两个重要的功能结构域。I1R-ISO-472在293T细胞中表达的蛋白相对分子质量约为52×103,与预测基本一致。细胞免疫荧光结果表明,其在293T细胞内呈均匀弥散分布。结论成功克隆一个新的I1R可变剪接体,其表达特征及亚细胞分布提示其药理学作用可能与已知的I1R不同。     

乙酰肝素酶信号肽对其活性功能的影响研究

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移过程中起关键作用,其信号肽在该酶翻译后处理过程中起重要作用.本研究旨在探索乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达特性及其信号肽对此酶功能活性的影响.方法:从人胎盘cDNA文库中扩增乙酰肝素酶全长编码基因,克隆入pGEM-T载体中,测序鉴定序列完全正确后,将此基因的全长和不含信号肽基因序列分别克隆入真核表达载体pcDNA4.1/Myc-His中构建pcDNA4.1/Myc-His full HPA和pcDNA4.1/Myc-His part HPA,转化COS-7细胞进行瞬时表达,分析这两种乙酰肝素酶蛋白的表达特性及功能活性.结果:在转染了乙酰肝素酶全基因的COS-7细胞裂解液中检测到该酶的功能活性及大小约53×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,为切割激活后乙酰肝素酶羧基端大亚基与标签蛋白的融合体.在转染了敲除信号肽的乙酰肝素酶基因的COS-7细胞裂解液中测到未被切割激活的大小约65×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,未能检测到该酶的功能活性.结论:在COS-7细胞中表达的完整的乙酰肝素酶蛋白和不含信号肽的乙酰肝素酶蛋白均位于细胞内,没有或很少被分泌到细胞外,提示该酶在正常状态下主要分布在细胞内.含信号肽的酶蛋白在翻译后处理过程中被细胞内的蛋白酶切割成2个亚基而被激活,具有功能活性.而不含信号肽的酶蛋白没有被切割而成为有活性的酶,提示乙酰肝素酶的信号肽对其翻译后加工、激活过程有重要的影响.     

重组人乙酰肝素酶在大肠杆菌中的表达、纯化

目的：表达纯化重组的人乙酰肝素酶（heparanase,HPA）。方法：以表达乙酰肝素酶全长质粒pcDNA3.1-HPA为模板,扩增不包括信号肽的乙酰肝素酶片段,将其插入pET-28a（＋）载体,转化到大肠杆菌BL21（plysS,DE3）中,在起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度4个方面对诱导条件进行了优化,实现了重组人乙酰肝素酶的可溶性表达。采用HisTrapTMcrude亲和层析对目的蛋白进行了初步纯化。结果：得到了初步纯化的HPA蛋白,Western印迹证实表达产物可被乙酰肝素酶抗体和His标签抗体识别,证明表达产物具有乙酰肝素酶的免疫学特性。结论：表达纯化的人HPA蛋白为特异性单抗的制备和鉴定提供了实验材料。     

乙酰肝素酶、组织蛋白酶D在宫颈癌的表达

目的探讨乙酰肝素酶(Hps)和组织蛋白酶D(CathD)与宫颈癌的发生、发展及预后的关系。方法取我院宫颈癌住院手术患者组织标本89例;宫颈上皮内瘤变(CIN)41例,正常宫颈组织35例。采用免疫组化SP法对乙酰肝素酶和组织蛋白酶D的表达进行检测。结果宫颈癌组织中乙酰肝素酶和组织蛋白酶D的免疫积分明显高于宫颈CIN组织及正常宫颈组织。而在CIN和正常宫颈组织间比较无统计学差异。乙酰肝素酶和组织蛋白酶D的表达与宫颈癌的临床分期、血管浸润和淋巴结转移有关。结论乙酰肝素酶和组织蛋白酶D可能在宫颈癌的发生、发展及预后中起着重要作用。     

eIF-5A的亚细胞定位研究

目的：研究eIF-5A的亚细胞定位,为了解其生物学功能提供线索。方法：借助免疫荧光技术和GFP标签技术,用激光共聚焦显微镜检测eIF-5A的亚细胞定位。结果：免疫荧光检测结果表明,eIF-5A定位于细胞质中;GFP-5A瞬时转染后,起初eIF-5A为全细胞分布,以后逐渐转移到细胞质中。第50位赖氨酸突变为丙氨酸后的eIF-5A则分布于整个细胞。结论：eIF-5A具有核质穿梭功能,它的亚细胞定位是个动态变化过程,hypusine可影响其亚细胞定位,进而可能影响其功能的发挥。     

高分辨率荧光显微成像技术在光敏剂亚细胞定位研究中的应用

目的　探讨应用由荧光显微镜及电感耦合器组成的高分辨率荧光显微成像系统研究血卟啉单甲醚 (hematoporphrinmonornethyletherHMME)亚细胞分布的可行性。方法　传代培养鼠肺毛细血管内皮细胞 ,与HMME共同孵育 2 4h ,选择 4种特异性细胞器荧光探针Rhodamine 1 2 3、Luciferyellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体 ,应用由荧光显微镜及电感耦合器组成的高分辨率荧光显微成像系统 ,分别采集细胞内HMME与细胞器探针的荧光图像。通过计算机图像处理 ,设计采用细胞器 细胞荧光强度比值法对HMME进行亚细胞定位。结果　在参数m的不同取值点 ,HMME在 4种细胞器区域与细胞平均荧光光强比值 (J1 /J2 )的差异有显著性 ,且各细胞器区域J1 /J2 大小排列顺序都为 :高尔基体 >线粒体 >内质网 >溶酶体 ;随参数m的增高 ,HMME在 4种细胞器区域平均光强比值呈下降趋势 ;细胞核区荧光微弱。结论　高分辨率荧光显微成像系统能对HMME及 4种细胞器探针进行荧光成像 ;应用此系统结合荧光定量分析法能对荧光效率极低的光敏剂进行较精确的亚细胞定位研究。     

新基因TIG-310的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21a免疫中的表达变化研究

目的：研究Ty21α免疫相关新基因(Ty21α immunization—associated gene，TIG—310)的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21α免疫中的变化规律。方法：采用PCR技术，扩增TIG—310可能的编码区，将其克隆至pQE30载体，在M15菌株中进行诱导表达；采用原位杂交技术对TIG—310基因的表达产物在肠黏膜组织进行细胞定位；将其亚克隆至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—N1，通过电击传染导入L细胞，确定其亚细胞定位；通过RT—PCR研究其在Ty21α免疫中的变化规律。结果与结论：TIG—310的编码区在原核表达系统中获得包涵体表达；原位杂交结果显示该基因表达在肠黎膜的上皮细胞中；与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果表明，该蛋白定位于整个细胞内。该基因在正常的BALB／c小鼠的胃肠黏膜高表达，在Ty21α第一次灌胃免疫后表达量显著增高，随着免疫次数的增加，TIG—310的表达量逐渐恢复正常。     

荧光显微成像技术在光敏剂亚细胞定位及损伤研究中的应用

一、光动力学疗法的基本原理及光敏剂亚细胞定位研究的重要意义光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)是指静脉或局部给予光敏剂,应用可见光或近红外光照射后吸收光子能量,在有氧状态下传递能量,产生对细胞有毒性的物质如单线态氧和其他氧自由基犤1犦。这些物质能和细胞内成分发生反应而造成细胞损伤。激发态单态氧寿命极短,在细胞内扩散不超过10～20nm。因此,靶细胞光动力损伤主要位点和光敏剂的亚细胞分布紧密相关犤2犦。研究发现由于细胞光敏损伤位点不同,其损伤特点及后果也不同犤3犦。一般认为,光动力作用引起细胞内线粒体损伤使靶细…     

小肝癌CT动脉期强化特征与乙酰肝素酶等生物学指标关系的研究

目的 探讨小肝癌动脉期强化特征与相关病理学及生物学指标的关系.方法 回顾性分析经手术病理证实的CT动脉期明显强化与无明显强化的小肝癌病例各35例,对照分析其病理学分级、血管生成情况及乙酰肝素酶(HPA)表达情况.结果 小肝癌CT动脉期明显强化与无明显强化2组间微血管密度(MVD)、HPA表达有统计学意义(P<0.05),与病理学分级无统计学意义(P>0.05).结论 小肝癌CT动脉期强化水平与其血管生成情况等生物学行为密切相关,可作为诊断及预后判断的有效指标.     

Apak的亚细胞定位机制研究

目的探讨P53的调控分子Apak亚细胞定位的结构基础。方法在热休克及DNA损伤诱导剂MMS处理下,通过免疫荧光技术观察Apak的亚细胞定位变化,并通过激光共聚焦荧光显微镜观察Apak截短体的亚细胞定位。结果 Apak多以均匀的形式分布在细胞核质,偶见在核仁中聚集;在外界刺激后Apak核内的均匀分布减少,主要以点状的大颗粒形式在核仁中呈聚集样分布;Apak的9种截短体均可定位于核内,且在核质和核仁中具有明显的比例差异。结论在DNA损伤信号下Apak有一个从核质向核仁移位的动态过程;KRAB区可以拮抗Apak在核仁的定位,而锌指尤其是锌指数的数目（锌指数〉14）则决定了Apak能否在核仁定位。     

PGEFP-C1/N载体的构建及其在转染细胞中的初步定位

目的观察SARS冠状病毒（SAR-CoV）N蛋白的亚细胞定位。方法将SARS-CoV N基因片段克隆人融合绿色荧光蛋白载体（PGEFP-C1）中。采用瞬时转染技术,在A549、VeroE6细胞株中利用荧光显微镜观察GPT-N蛋白的亚细胞定位,Westem blot鉴定N蛋白的表达。结果成功构建了PGEFP-C1／N表达载体,在A549、VeroE6细胞中观察到N蛋白定位于细胞胞浆中,Western blot证实了N蛋白表达。结论SARS-CoV N蛋白在真核细胞中定位于细胞胞质中。     

重组人α-半乳糖苷酶A在CHO细胞中的表达及鉴定

目的 构建重组人α-半乳糖苷酶A(GLA)真核表达载体,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达重组的人GLA.方法 利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人GLA cDNA,并构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A中.将重组质粒转染CHO细胞并用G418筛选.用丁酸钠诱导G418抗性细胞,检测培养上清中的GLA活性,筛选高表达GLA的细胞株.采用HisTrapTM FF纯化培养上清中的GLA蛋白并利用Western 印迹进行鉴定.结果 成功构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达,得到高表达量的单克隆(蛋白比活为1935 U/mg).纯化后的培养上清在50×103(Mr)附近出现单一条带,通过Western 印迹确定为GLA蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,获得了具有生物活性的重组人GLA,为临床上治疗法布莱病奠定了一定基础.     

人分化相关基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位研究

目的 :研究人源分化相关新基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位。方法 :采用电子拼接和PCR扩增技术 ,从人 2 2周孕龄胎肝cDNA文库中获得与人Ndr1基因同源的一段表达性序列标签 ,继而从成人脑cDNA文库分离出Ndr3的全长cDNA ;采用点杂交分析和多组织Northern杂交分析方法 ,确定其组织表达谱 ;将其亚克隆入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP_N1,用脂质体介导法转染COS_7细胞 ,确定其亚细胞定位。结果与结论 :Ndr3的全长cDNA为 2 879bp ,其开放阅读框 (ORF)编码 375个氨基酸 ,染色体定位为 2 0q12_11.2 3。Northern杂交和点杂交分析显示 ,NDR3在脑组织和睾丸中高表达 ,在肾、心肌和前列腺中有一定量的表达 ,在胚胎组织的表达较低 ,在 8种人肿瘤细胞中的表达极低。与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果显示 ,该蛋白定位于核外胞浆内     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。