Rack1敲低促进TGF-β诱导的A549细胞的上皮-间充质转化

目的 研究Rack1分子在TGF-β诱导A549细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的功能.方法 制备携带不同Rack1干涉序列的慢病毒颗粒,并感染A549细胞建立稳定细胞系.选取敲低效率较高的细胞系,利用MTS、细胞划痕、免疫印迹等技术检测Rack1敲低后细胞的增殖、TGF-β诱导的迁移及相关分子表达水平的改变.结果 获得了Rack1稳定敲低的细胞系,Rack1敲低后细胞增殖减慢,TGF-β诱导的迁移加快,钙黏蛋白E(E-cadherin)下调和胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平升高.结论 Rack1分子敲低促进EMT的发生.     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响.方法 应用RNAi技术,以化学合成的survivin小干扰RNA(siRNA)体外转染A549细胞,采用MTT法及流式细胞仪检测转染前后A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,通过RT-PCR及Western blot分析survivin mRNA和蛋白的表达情况.结果 survivin siRNA对A549的生长抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05),并能引起G1期细胞比率的增加和S期细胞相应的减少,诱导一定数量的细胞凋亡,转染后36、60、84、108、132h的IC50值分别为152.4、151.2、136.0、144.0、150.4nmol/L.100～200nmol/L siRNA转染组细胞的survivin表达在蛋白及RNA水平都显著低于对照组(P＜0.01),但空白对照组与空质粒组间无明显差异(P＞0.05).结论 应用siRNA沉默survivin基因可以下调肺腺癌A549细胞survivin的表达,进而抑制细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡.RNAi的抑制效果具有特异、高效和持久的特点.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

红芪多糖诱导肺腺癌细胞凋亡与Bax/Bcl-2表达的研究

目的:探讨红芪多糖对A549细胞凋亡及Bax/Bcl-2 mRNA表达的影响。方法:MTT法检测红芪多糖对A549细胞生长的抑制作用,流式细胞仪检测红芪多糖对A549细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测红芪多糖对A549细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响。结果:不同浓度的红芪多糖对肺腺癌细胞生长均有抑制作用,抑制率与浓度呈正相关;不同浓度红芪多糖均可诱导A549细胞凋亡,并呈现浓度依赖性;不同浓度红芪多糖均可降低Bcl-2蛋白的表达,相应提高Bax蛋白的表达,呈浓度依赖性。结论:红芪多糖可抑制A549细胞生长,并诱导其凋亡,且可能通过调节细胞内Bax和Bcl-2的表达从而诱导A549细胞凋亡。     

辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用

目的 寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因。方法构建辐射相关的基因芯片，初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因。为了评价芯片结果的可靠性，我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证。结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比，辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变，8个基因是上调，10个基因是下调。在照射后6h和24h，A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调，3个下调)和26个基因(8个上调，18个下调)的差异表达；NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调，8个下调)和18个基因(6个上调，12个下调)差异表达。从这些基因中，我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因，在照射后的A549细胞中是增高的，而在NCI-H446细胞中是降低的。另外一些参与DNA修复的基因，在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达。结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成。     

伊马替尼和十字孢碱对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

目的探讨伊马替尼（STI571）、十字孢碱（STS）对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响。方法经STI571和STS处理后,通过Western印迹检测A549细胞内凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）的变化,然后利用膜联蛋白（annexin）Ⅴ-FITC PI凋亡试剂盒,借助流式细胞仪,检测A549细胞凋亡;利用Hoechst染色检测A549细胞凋亡现象并通过免疫荧光技术检测细胞内AIF和线粒体的变化。结果 Western印迹检测结果显示,STI571和STS处理能够提高AIF在A549细胞内以相对分子质量为57×103的形式表达;流式细胞仪检测结果显示,STS处理组膜联蛋白ⅤFITC染色的细胞数随着STS处理时间的增加呈现先增后降的趋势,溴化乙锭PI染色的细胞数随着处理时间增加到20 h呈现增多的趋势;STI571处理组膜联蛋白ⅤFITC的染色结果和溴化乙锭的染色结果与对照组相比,变化均不显著;STI571与STS共同作用组膜联蛋白ⅤFITC染色细胞数少于STS单独处理组结果,溴化乙锭染色的细胞数明显多于STS单独处理组;Hoechst染色结果显示,STS处理组和STI571、STS共同处理组细胞核内染色质发生凝集;间接免疫荧光结果显示,AIF发生聚集且细胞内线粒体染色亮度减弱。结论 STS和STI571处理能够引起细胞内AIF分布形式上的变化,STS可引起A549细胞发生细胞凋亡,STI571处理不能引起细胞发生凋亡,但能引起细胞内AIF发生聚集并对STS引起的细胞凋亡有促进作用。     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制。方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin。酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性。结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin 蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t₁=10.63,P<0.001;t₂=3.75 ,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D₀、D_q无明显变化,而pGenesil2-survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性。结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性。     

神经纤毛蛋白1对非小细胞肺癌放射敏感性的影响

目的 探讨神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1,NRP1)在不同种类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的表达情况及其与肿瘤放射敏感性的关系.方法 通过Western blot技术检测不同来源的5种人NSCLC细胞系(H358、H460、H1299、A549、SK-MES-1)NRP1的基础表达水平,MTT方法检测经不同剂量X射线照射后肺癌细胞的存活情况,初步筛选5种细胞中辐射敏感和辐射抵抗的2种细胞;采用克隆形成实验及流式细胞术分别检测细胞存活分数及凋亡率的变化,分析2种肺癌细胞的放射敏感性,采用Western blot检测2种细胞受X射线作用后 NRP1 的表达变化,通过克隆形成实验检测靶向抑制NRP1对A549细胞放射敏感性的影响.结果 5种肿瘤细胞NRP1表达量由高到低依次为:A549>SK-MES-1>H358>H460>H1299;X射线对肿瘤细胞的抑制能力呈剂量依赖性增强,其抑制率由高到低依次为:H460>H1299>H358>SK-MES-1>A549,因此选取A549细胞和 H460细胞做后续研究.克隆形成实验显示,A549在2 Gy照射下的存活分数(SF₂)是0.887,而H460细胞为0.313.A549细胞受照后的凋亡率为对照组的122.54%,明显低于H460细胞的238.88%.辐射可以诱导A549细胞NRP1的表达上调达40%,同时靶向抑制NRP1则可以增强A549细胞的放射敏感性.结论 在NSCLC细胞中A549细胞具有较强的辐射抗性,且辐射抗性的形成与其NRP1表达上调有关.     

32P与顺铂联合应用对肺癌细胞凋亡的影响

目的观察^32P照射对肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响及其机理。方法用^32P溶液对A549细胞进行内照射，用顺铂进行化疗。通过四唑盐(MTT)比色法计数、流式细胞术、透射电镜及免疫组织化学检测等方法，观察A549细胞的细胞存活率、细胞凋亡率、细胞超微结构改变及相关基因表达。结果随^32P放射性浓度和顺铂剂量增加，A549细胞存活率明显下降，且两者间存在协同作用；联合应用低剂量顺铂(2．5μg/ml)和低放射性浓度(555kSq／ml)^32P时，A549细胞存活率明显下降。细胞凋亡率上升，细胞超微结构改变，且在诱导细胞凋亡过程中，P53、bax基因表达上调，bcl-2／bax比值下调。结论低放射性浓度^32P溶液与顺铂联合应用，既能有效促进A549细胞凋亡，又能明显降低两者剂量．减少毒副作用．