贵阳地区2013年手足口病非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的检测分析

目的：了解贵阳地区引起手足口病（HFMD）的非肠道病毒71型（EV71）、非柯萨奇病毒 A（CVA）16型肠道病毒的病原构成及优势型别,为贵阳地区 HFMD 防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的 HFMD 患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸,用巢式 RT-PCR 法扩增病毒 VP4区序列,对 PCR 阳性扩增产物进行测序,通过与 GenBank 收录的序列 BLAST 比对确定病毒型别;并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式 RT-PCR 检测为阳性（93％）,其中100例 PCR 产物测序成功,经 BLAST 比对后,100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例,CVA10为30例,CVA5为10例,CVA2为6例,CVA3和 CVA4各2例,CVB2和 ECHO16各2例。 CVA6在型别确定的非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中占42．99％,为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起 HFMD 的肠道病毒型别多样,CVA6为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中的优势型别。     

四川省德阳市柯萨奇病毒A组5型基因特征分析

目的 分析四川省德阳市手足口病病例中的柯萨奇病毒A组5型（coxsackievirus A5,CVA5）的基因特征,为防控CVA5提供科学依据。方法 对德阳市2013—2021年手足口病监测中收集到的疑似病例咽拭子标本,采用实时荧光聚合酶链反应（real-timefluorogenicquantitativepolymerasechainreaction,Q-PCR）进行肠道病毒核酸检测,选择Q-PCR检测结果 CT值<30的非肠道病毒71型（EV-A71）/柯萨奇病毒A组16型（CVA16）的其他肠道病毒核酸阳性标本,分别进行VP4/VP2区和VP1区基因扩增和核苷酸测序,再用MEGA 7.0. 26软件构建CVA5系统进化树,分析其基因特征。结果 2013—2021年德阳市共收集手足口病疑似病例标本3 115份,经Q-PCR检测非EV-A71/CVA16的其他肠道病毒核酸阳性标本为1314份;选择其中的353份标本进行VP4/VP2区和VP1区核苷酸测序,在280份标本中检测出8种肠道病毒型别,其中10份为CVA5。德阳市10份CVA5标本之间,VP1区核苷酸序列相似性为91...     

2011年广州市手足口病病原谱分析

目的了解引起2011年广州市手足口病流行的病原体,确定其型别分布特征。方法收集手足口病疑似病例标本,用Real-time RT-PCR、巢式RT-PCR方法对其部分VP1基因进行扩增并测序,确定其病原谱构成,构建系统发育树。结果共收集2 067例疑似手足口病病例标本,其中实验室确诊肠道病毒阳性1 113份,包括EV71、CoxA16、CoxA6、CoxA10、CoxA9、HEV96、埃可病毒和柯萨奇B组等15种肠道病毒,其中EV71、CoxA16和CoxA6是主要病原体,分别占32.6%、39.2%和18.5%;死亡病例3例,全部由EV71引起;重症病例9例,6例由EV71引起,3例由CoxA6引起。VP1基因构建进化树分型发现,广州市2011年手足口病病原体属于HEV-A(97.2%)、HEV-B(2.5%)、HEV-C(0.3%)3个型别,未发现HEV-D型毒株。结论广州市2011年手足口病的流行主要由HEV-A型的EV71、CoxA16和CoxA6病毒引起,同时还存在HEV-B型和HEV-C型的CoxA9、EC、CoxB、CoxA24多种病毒。     

重症手足口病180例病原学检测及肠道病毒71型基因特征分析

目的 探讨重症手足口病病原学特征,分析肠道病毒71型(EV71)基因型的特征.方法 重症手足口病患儿180例,采集发病一周内的咽拭子或肛拭子标本,应用实时反转录-聚合酶链反应方法检测标本中的肠道病毒.分别选取2014年及2015年各5例EV71检测阳性标本扩增基因的VP1区,测序并比对,构建进化树分析.结果 180份标本中肠道病毒核酸阳性153份,阳性率85.00％.153份阳性结果中EV71核酸阳性占50.3％ (77/153),柯萨奇病毒A组16型(CVA16)核酸阳性占19.6％ (30/153),其他肠道病毒核酸阳性占30.1％ (46/153).2014年及2015年以EV71为主,CVA16较少,两年间病毒型别构成比较,差异无统计学意义(P＞0.05).多元线性回归分析示,拟合回归方程:Y =2.095X1+0.462X2-0.214,式中Y为重症病例数,X1为EV71病例数,X2为其他肠道病毒病例数.EV71数可反映99.7％重症病例变化.不同年龄间病毒型别构成比较,差异无统计学意义(P＞0.05).发病高峰集中在每年4～8月;发病以4岁以下儿童为主,占82.7％,尤其是1～3岁年龄段(57.8％).EV71 VP1区与C4a基因型代表株核苷酸同源性为91.6％ ～92.5％,氨基酸同源性为97.5％ ～ 98.8％,亲缘进化分析显示EV71与C4a基因型代表株处于同一分支.结论 EV71是本地区重症手足口病患儿主要病原,且属于C4a基因亚型.     

奉化市2010—2013年手足口病病原监测及病毒基因分析

目的探讨手足口病临床病例样本的肠道病毒流行特征。方法收集350例临床诊断为手足口病患者的咽拭子、血浆和粪便标本387份,采用巢式PCR方法进行肠道病毒的检测,对肠道病毒阳性的标本应用测序方法根据5’UTR基因序列进行病毒分型。结果在350例临床诊断病例中,病原学诊断或者核酸检测阳性病例245例,其中男138例,女107例,性别比1.54∶1。387份临床样本中,肠道病毒阳性共217份,检出率为56.1%。245例病原学诊断或核酸检测阳性病例中,人肠道病毒71型(EV71)125例,占51.0%;柯萨奇病毒A组(CVA)16型90例,占36.7%;其他型肠道病毒20例,占8.2%;有10份阳性病例无法鉴定分型,占4.1%。结论奉化市2010—2013年手足口病以EV71及CVA16型为主,其中2010—2012年以EV71为主,2012—2013年以CVA16为主,其他型如CVA4、CVA6、CVA10、CVA12及CVB3等也有发现。     

2009年湖南省哨点医院手足口病病原学检测与分析

目的 针对2009年湖南省哨点医院手足口病(HFMD)实验室检查结果进行分析,为湖南省HFMD的综合防治提供参考资料. 方法 收集湖南省2009年4～12月份监测哨点医院HFMD病例送检的咽拭子、粪便、疱疹液等标本,用RD、Hep-2细胞进行病毒分离,应用RT-PCR技术检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)、非EV71和CVA16的其它肠道病毒(EV). 结果 374例HFMD患者的551份各类样本中EV71病毒、CVA16病毒、EV71和CVA16病毒以及EV的检出率分别为:35.02%、12.30%、0.27%、25.40%.三种不同型别肠道病毒的在全年中交替变更;病例人群男性高于女性(1.99∶1),其中1～2岁儿童是病例数和重症病例数最多年龄段;52例HFMD重症病例中,EV71的检出率高于CVA16(P<0.01);对不同类型的阳性标本进行病毒分离,共获67份阳性毒株,包括EV71型43株,CVA16型5株,EV型16株,混合毒株3株(EV71+CVA16型1株,EV71+EV型1株,CVA16+EV型1株).不同类型标本的肠道病毒阳性检出率和阳性检出构成差异均有显著性(P<0.05),粪便标本的检测阳性率和分离率最高. 结论 EV71型是2009年湖南省HFMD流行的主要致病病毒,同时也是引起手足口重症病例和死亡病例的主要毒株类型.     

湘潭市手足口病病原学实验室检测分析

目的:根据手足口病病原学检测结果分析该病流行特征,同时评估从不同部位采集样品的阳性检出率,为手足口病的防控提供科学依据。方法:临床诊断为手足口病例的咽拭子标本,疱疹液标本,粪便标本,采用实时荧光(定量)PCR进行检测,对总肠道病毒阳性的标本,进行EV71和CA16分型,检测结果分组统计分析。结果:在652份监测病例样品中,总肠道病毒阳性样品446份,其中EV71阳性199份,占44.52%;CA16阳性176份,占39.37%;其它型肠道病毒阳性71份,占15.97%。在103份重症病例样品中,总肠道病毒阳性91份,其中EV71阳性77份,占84.62%,CA16阳性3份,占3.29%,其它型肠道病毒阳性10份,占10.10%。结论:湘潭市手足口病流行病原以EV71型和CA16型交替流行;重症病例主要由EV71引起;疱疹液,粪便标本的阳性检出率高于咽拭子。     

1起由肠道病毒CA6引起的手足口病聚集性疫情的病原学鉴定

目的对2015年6月开封市1所幼儿园发生的1起由CA6型肠道病毒引起的手足口病聚集性疫情进行病毒型别快速鉴定。方法采集病例及密切接触者的粪便标本,运用荧光定量PCR方法进行总肠道病毒、CA16、EV71和CA6检测,并采用半巢式PC R方法进行肠道病毒VP1序列扩增,对目的条带测序鉴定肠道病毒型别。结果 24例病例24份标本中22份标本检出总肠道病毒阳性,36名密切接触者36份标本中有10人10份标本检出阳性,肠道病毒阳性率分别为91.67%和27.78%,其中分别有22例病例和6名密切接触者CA6阳性,阳性率分别为91.67%和16.67%,所有标本CA16和EV71检测阴性。6例病例和3名密切接触者的9份标本半巢式PCR扩增阳性,测序结果显示VP1序列均为CA6。结论开封市此次发生在幼儿园的1起手足口病聚集性疫情由肠道病毒CA6型引起;荧光定量PCR与半巢式PCR扩增肠道病毒VP1序列能快速准确的鉴定CA6型肠道病毒。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征,为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病(HFMD)患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega5.0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果 154份,阳性率为51.33%;CoxA16阳性结果 38份,阳性率为12.67%。测序结果表明,8株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为96.9%~99.2%,氨基酸同源性为99.3%~100%。VP1区基因遗传进化分析表明,8株EV71分离株与C4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

贵阳地区2015年手足口病柯萨奇病毒A6、A10型的检测分析

目的 了解贵阳地区2015年引起手足口病(HFMD)的柯萨奇病毒(CV) A6、CVA10型肠道病毒(EV)的病原构成情况,为本地区HFMD防治提供依据.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立荧光定量RT-PCR方法体系,用基因测序法进行验证,然后利用该方法对607例HFMD临床病例标本进行检测.结果 共检测HFMD疑似病例607例,总阳性率为59.47％(361/607),其中EV71占7.25％ (44/607),CVA16占11.37％ (69/607),EV71和CVA16双阳性占0.16％ (1/607),其他EV占40.69％(247/607).用建立的实时荧光RT-PCR法检测出CVA6、CVA10和CVA6+CVA10型阳性样本分别为11、71和1例[总阳性率13.67％ (83/607)],且与基因测序法结果完全符合.结论 CVA6、CVA10是贵阳地区2015年HFMD新发的主要病原,应加强对其型别的监测.     

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

大连市肠道病毒71型基因特征分析

目的 了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的VP1区段的基因特征.方法 用RT-PCR方法从手足口病患者临床标本中扩增EV71的VP1基因全序列,利用软件进行同源性分析和构建系统发生树.结果 测序获得的9株病毒基因与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性.在系统进化树上,9株病毒基因与C4基因亚型代表株处于同一分支.结论 大连市EV71病毒株属C4亚型.     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

基于定型肠道病毒VP1基因的不同巢式或半巢式PCR评价

目的评价三组基于肠道病毒定型的VP1基因的不同巢式或半巢式PCR方法,建立一种快速、灵敏的分子检测方法用于直接检测临床样品。方法从文献中选出目前常用三组引物,外加一对针对B群肠道病毒改良引物。对代表A群肠道病毒的CVA16毒株和代表B群肠道病毒的CVB5和ECHO20三个毒株分别进行连续10倍稀释至10^-7,对稀释度为10^-3~10^-7的病毒株进行巢式或半巢式PCR。对20份手足口病（HFMD）患儿的粪便样品和16份病毒性脑炎的脑脊液样品进行巢式或半巢式PCR。结果所选三组引物均能检测2.50CCID50/ml CA16病毒;在CVB5和ECHO20检测中,Leitch等设计的引物灵敏度最高,即能够检测含1.12CCID50/ml和1.00CCID50/ml的病毒。在粪便临床样品检测中,Iturriza-Gómara等设计的引物阳性率最高,其中A群肠道病毒检测率为55.0%（11/20）,B群为10.0%（2/20）;而Leitch等设计的引物检测率则为A群为15.0%（3/20）,B群为45.0%（9/20）,其次为Nix等设计的引物检测率为45.0%（其中A群为30.0%,B群为15.0%）,改良的引物为20.0%（4/20）。但脑脊液样品仅有Leitch等设计引物检出,而检出率仅为6.25%（1/16）。结论 Iturriza-Gómara等设计的A群肠道病毒的引物和Leitch等设计的B群的引物组合检测临床样品最佳。     

2011-2013年手足口病病原谱及临床特征分析

目的：探讨2011-2013年手足口病（HFMD）病原体变化趋势。方法采集4064例在我院就诊的HFMD患者的咽拭子标本并提取核酸,采用实时荧光定量PCR方法检测肠道病毒通用型（EV）,肠道病毒71型（EV71）及柯萨奇病毒A组16型（CA16）。结果3年间6岁以上患儿占96.0%;发病以5~7月份为主,占73.5%。2011-2013年HFMD 患者 EV71、CA16和未分型肠道病毒的检出率依次为42.6%、35.3%、18.5%,16.1%、22.6%、11.5%,41.3%、42.1%、70.0%,差异有统计学意义（x2=343.3,P＜0.05）。2013年EV71、CA16检出率明显低于2011、2012年,未分型病毒检出率明显增高（P均＜0.017）。613例重症HFMD患儿中,EV71感染占59.2%、CA16感染占11.1%,未分型病毒感染占29.7%,且均以肺炎合并脑干脑炎为主。结论2011-2013年HFMD病原谱发生了变化,未分型肠道病毒增多,需引起重视。     

镇江地区肠道病毒71型VP1基因的检测及系统进化分析

目的检测我国镇江地区2008年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71),并进行毒株的种系进化分析。方法采集临床HFMD患者粪便标本,抽提病毒RNA,通过巢式聚合酶链反应技术进行特异性扩增。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本,采用EV71特异性引物对其VP1区的核苷酸序列进行扩增。扩增的VP1片段经纯化后与测序载体PET32a(+)连接,转化大肠埃希菌DH5α,并对阳性质粒进行酶切和测序鉴定。利用Clustalx和MEGA4.0分析软件,进行系统进化分析。结果通过聚合酶链反应扩增获得EV71VP1基因,根据遗传进化分析发现该病毒株与1999、2000年在美国亚特兰大以及2000年中国北京地区流行的EV71型遗传距离较近,均属于C型。结论镇江地区HFMD患者中分离的EV71病毒株属C基因型。