新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的 调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体(Ot)情况,并对媒介昆虫进行调查.方法 采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR( nPCR)检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离.结果 共采取人群血液2 430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5 783个(只),从5种啮齿动物(小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭)、2种鸟类(麻雀、灰腹鹡鸰)的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot.其他动物体内未检测到Ot.从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot.基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型.结论 新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型.     

105例恙虫病疑似患者巢式PCR检测结果分析

目的对泰州市靖江105例恙虫病疑似患者全血进行恙虫病东方体(Ot)检测,分析该地区恙虫病感染情况,为恙虫病预防控制提供科学依据。方法采集靖江市2013年10~11月的105例恙虫病疑似患者全血样品进行巢式PCR检测,并进行个案调查,记录结果,用描述性分析方法对检测结果及个案资料进行分析。结果 105例疑似患者中62例检出恙虫病东方体核酸阳性(阳性率59.0%)。发病人群年龄以50~80岁为主,占69.4%,实验室诊断病例中农民占82.3%,男女性别之比1:1.7。结论靖江市恙虫病发病率较高,应针对流行特征采取综合防制措施。     

海南省680例不明原因发热患者恙虫病东方体感染调查

目的 了解海南省不明原因发热患者的恙虫病东方体检感染情况,为不明原因发热患者恙虫病防治提供指导。方法 收集2018—2021年海南医学院第一附属医院、海南医学院第二附属医院、海口市人民医院和琼中黎族苗族自治县人民医院临床诊断为不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和PCR方法分别对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时收集样本的临床及流行病学信息,并进行流行病学分析。结果 共收集临床不明原因发热患者血样680份,恙虫病东方体IgM、IgG抗体和56kD型特异性抗原PCR阳性率分别为23.97%(163/680)、36.62%(249/680)和20.88%(142/680),焦痂或皮疹率为12.06%(82/680)。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为223例,其中男性111例（49.78%）,女性109例（48.88%）,平均年龄（53.14±15.12）岁,其中40～<60岁98例（占43.95%）,感染人群民族中汉族136例（占60.99%）,农民93例（41.70%）,秋季发病114例（51.12%）。临床...     

珠海市恙虫病流行特征及恙虫病东方体分离研究

目的了解珠海市恙虫病流行特征并分离恙虫病东方体,从而为积极有效地预防做准备。方法对本地区恙虫病流行特征进行描述性分析;采用小白鼠腹腔接种法分离恙虫病东方体。结果珠海市恙虫病全年以散发为主,属夏秋型;男女病例分布无明显性别差异;各个年龄组均有病例分布,以41－70岁年龄段分布最多;患者职业以农民分布病例数最多。恙虫病东方体分离镜检可见：紫红色圆形、椭圆形、短杆状的恙虫病东方体颗粒。结论珠海恙虫病属夏秋型,且不同的年龄、职业的恙虫病患者分布存在差异。     

恙虫病东方体Ot56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从Gen Bank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、Athe Port和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4％-100.0％,变异度为0.0～57．1;氨基酸的105-171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区：膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8％～100.0％,变异度为0.0～116．1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株（型）特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株（型）鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株（型）恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

恙虫病东方体0t56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从GenBank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、AthePort和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4%～100.0%,变异度为0.0～57.1;氨基酸的105～171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区;膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8%～100.0%,变异度为0.0～116.1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株(型)特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株(型)鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株(型)恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体,为表达该基因奠定基础。方法:以恙虫病东方体Karp株基因组为模板,通过PCR方法扩增Sta22抗原基因,并将其克隆到表达载体pEASY-E2上,通过PCR方法及核苷酸测序进行鉴定。结果:所构建的原核表达载体携带Sta22基因,基因序列与GenBank上所公布的信息完全一致。结论:成功构建了Sta22抗原基因的原核表达载体,为研制和开发新型的恙虫病疫苗及临床诊断试剂奠定理论基础及物质保障。     

海南省琼中黎族苗族自治县2019年恙虫病东方体分子流行病学及遗传进化分析

目的 通过分析海南省琼中黎族苗族自治县（简称“琼中”）98例不明原因发热患者的恙虫病流行特点,了解该地区恙虫病东方体菌株流行的情况,为该地区制定恙虫病防治策略和控制措施提供科学依据。方法 收集2019年 1月1日至2019年12月31日琼中黎族苗族自治县人民医院诊断为疑似恙虫病和不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和巢式PCR方法对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时使用预先设计的样本信息表收集患者的临床表现及流行病学信息。针对巢式PCR检测结果为阳性的样本,进行克隆及Sanger测序。对获得的患者临床信息及检测结果进行流行病学分析,将测序得到的序列进行基因遗传进化分析。结果 98例样本中,恙虫病IgM抗体阳性率为24.49%（24/98）,恙虫病IgG抗体阳性率为46.94%（46/98）,恙虫病PCR阳性率26.53%（26/98）,焦痂或皮疹13.27%（13/98）。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为33例。感染人群主要以31~50岁的青壮年为主,职业主要为农民。该地区恙虫病的流行以营根镇、长征镇和红毛镇为主并涉及9个乡镇。流行时间有明细的季节性,以7月和11月为主要高发期。流行的基因型主要为Karp型和Gilliam型。结论 琼中为恙虫病的自然疫源地,该地区流行的恙虫病东方体基因型主要为Karp和Gilliam型,具有基因多态性。     

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的 扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长，并进行序列比较研究。方法 小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株，用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因，并采用TA克隆技术构建测序载体，对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长，并TA克隆到测序载体pMD18—T vector，测序结果与Karp标准株的同源性为99．4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功，为进一步构建表达载体，进行Sta56蛋白表达研究提供基础。     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用

目的：构建问号钩端螺旋体（简称钩体）黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白（rGroEL）对金地鼠的免疫保护作用。 方法：采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率。采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价。 结果：所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同。所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL。100和200 μg rGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%。rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。 结论：GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗。     

海南汉族和黎族冠心病人群ACE基因多态性的对比分析

目的探讨ACE基因插入,缺失（D／I）多态性在海南汉、黎族冠心病中的意义。方法采用聚合酶链反应（PCR）方法。对海南汉族150例冠心病人及150例汉族正常人、150例黎族冠心病人及150例黎族正常人的ACE基因D／I多态性进行检测,观察DD、DI、II基因型频率,并对所有普通PCR定为DD型的样本进行插入特异性PCR检测,以减少误分型率,同时检测其血脂、裁脂蛋白、血压、血糖等,并经多元逐步回归分析了解引起冠心病的危险因素。结果汉、黎族冠心病组的DD基因型频率较各自对照组高（P〈0．05）,而汉、黎族冠心病组间的比较DD、DI、II基因频率比较无显著差异。经多元逐步回归分析显示：汉、黎族冠心病组ACE基因DD基因型频率增高,HDL-C降低,汉族冠心病组TG水平升高。结论ACE基因DD基因型频率增高与冠心病有关,海南汉、黎族冠心病ACE基因多态性的易感性一致。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

肝硬化失代偿期患者腹水、胸水及血液中16S rRNA基因检测

为寻找诊断肝硬化失代偿期并发自发性腹膜炎、胸膜炎和败血症时检测病原菌的方法。采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增真细菌域的１６ＳｒＲＮＡ基因，与Ｇｒａｍ阴性和Ｇｒａｍ阳性特异探针杂交检测肝硬化失代偿期患者胸腹水和血液中的致病菌。结果：ＰＣＲ腹水检测病原菌的阳性率９１４％；Ｇｒａｍ阴性探针斑点杂交（Ｄｏｔｂｌｏｔ）阳性率１００％；Ｇｒａｍ阳性杂交阳性率２１７％，高于细菌培养和鲎试验。结果提示：用ＰＣＲＤｏｔＢｌｏｔ杂交法检测病原菌的１６ＳｒＲＮＡ基因是诊断肝硬化自发性腹膜炎、胸膜炎和败血症等各种细菌感染的一种新方法     

用母体外周血中胎儿游离DNA检测胎儿SRY基因的研究

目的探索从孕妇外周血浆中检测胎儿躲y基因的高灵敏性及高准确性方法。方法应用PcR、实时荧光定量PcR、PEP—PcR技术,检测33例妊娠8～14周的正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的脓y基因。组织标本躲y基因检测结果作为性别判定的标准。结果33例孕妇血浆标本检测职y基因,普通PcR检出的灵敏性为58．82％,特异性100％。PEP—PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。荧光定量PCR的灵敏性为88．24％,特异性100％。结论PEP—PCR技术和荧光定量PcR技术均可以提高胎儿游离DNA检测的灵敏度及准确性．可用于进一步染色体疾病的无创性产前筛查研究。     

三种性分化异常综合征患者的SRY基因检测

目的 探讨K1inefelter综合征、46，XY女性性反转综合征和Turner综合征患者是否存在SRY基因，进一步了解SRY基因在性分化中的作用。方法 用SRY特异性引物通过PCR方法检测三种性分化异常患者外周血淋巴细胞SRY基因。结果 7例Klinefelter综合征患者有1例未测出SRY基因，6例SRY基因阳性；3例46，XY女性综合征患者SRY基因均阳性；7例Turner综合征患者SRY基因皆阴性。结论 SRY基因是睾丸分化和发育的关键基因，但正常男女性分化还需要其他基因或因素的作用。     

海南汉族人群AGT基因多态性与冠心病的相关性

目的:探讨AGT基因T174M和M235T多态性与海南汉族冠状动脉性心脏病(CHD)的关系。方法:应用等位基因特异性PCR技术,对334例海南地区汉族CHD患者和193例海南汉族正常对照组中AGT基因T174M、M235T多态位点进行了检测,分析两组基因型频率及等位基因频率。结果:M235T多态位点的等位基因在海南汉族正常对照组和CHD患者组之间存在差异(χ2=4.314,P=0.038);T174M多态位点的基因型在汉族正常对照组和CHD患者组之间也存在差异(P=0.047,Fisher确切概率法)。结论:AGT基因T174M、M235T多态性与海南汉族人群CHD均相关,M235T多态位点235M等位基因是海南汉族人群CHD的易感基因,T174M多态位点174TT和174MM基因型可使海南汉族人群CHD的患病危险性增加。     

巢式聚合酶链反应检测血液中恙虫病立克次体56kDa抗原基因

目的通过恙虫病立克次体５６ｋＤａ抗原基因片段检测,探讨早期病原诊断的方法。方法采用巢式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）对１１例确诊及１０例疑诊恙虫病患者血液标本进行检测,并以血清ＩｇＧ抗体间接免疫荧光试验（ＩＦ）对比分析。结果１１份ＩＦ检测阳性的标本,ＮＰＣＲ均阳性;１０份ＩＦ阴性的标本,７例ＮＰＣＲ检测阳性,总阳性率为８５．７％。而作为阴性对照的１０份血标本则无阳性。结论本法用于临床血液标本中恙虫病立克次体ＤＮＡ的快速检测,具有敏感性高、特异性强的优点。     

海南省四个疟区市(县)1998～2001年发热病人血片复检结果分析

疟疾的诊断目前仍以采集患者末梢血 ,制作血片染色后显微镜检查疟原虫 ,作为主要手段和可靠方法。在各类疟区中对于“四热”(临床诊断疟疾、疑似疟疾、感冒及原因不明的发热病人 )病人的血检 ,是疟疾防治管理工作中的一项常规操作技术和评价指标。为此 ,复检和分析基层疟疾血片的质量 ,对于准确反映疟疾疫情和加强防治措施具有重要意义。现将1998年以来白沙、琼海、屯昌、澄迈 4个疟区市 (县 )的血片复核结果分析报告如下。1　材料和方法1 1　复检血片来源　对 (1998～ 2 0 0 1年 )白沙、琼海、屯昌、澄迈 4个市县疟疾联防区“四热”病人 (…