IL-12基因重组卡介苗免疫效应研究

目的:本研究在已构建人IL-12基因重组卡介苗(rBCG-12),并在体外成功诱导表达IL-12的基础上,进一步研究其免疫后在小鼠体内诱导细胞和体液免疫应答的能力,探讨rBCG-12免疫后对小鼠免疫效应的影响。方法:近交系BALB/c小鼠36只,随机分3组:BCG组、rBCG-12组与PBS组。实验小鼠皮下多点注射细菌悬液0·3mL/只,其中活菌量为1×106 CFU/mL,免疫一次,PBS组仅注入PBS液。末次免疫后6周、8周、10周、12周分别分离小鼠血清测定特异性抗体水平,同时分离脾细胞,体外培养经BCG-PPD刺激后检测脾细胞增殖(XTT比色法)活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)分泌水平。结果:PBS对照组各时间点均未检测到特异性抗体的产生。免疫后8周时rBCG-12组检测到抗体产生,而BCG组在免疫后10周才检测到抗体产生,且10周时与rBCG-12组抗体水平差异无统计学意义,之后两组抗体水平均有明显增高,免疫后12周时抗体滴度分别达到了1/640(rBCG-12)组和1/320(BCG组)(P<0·05)。BCG组与rBCG-12组间脾细胞增殖反应变化趋势相同,但rBCG-12组增殖反应明显强于BCG组(P<0·05)。免疫后10周时两组细胞增殖均达到最高峰,之后逐渐下降,rBCG-12组较BCG组下降缓慢,12周时rBCG-12组的增殖反应仍然维持在高水平。免疫后6~8周BCG组和rBCG-12组IFN-γ的产生均呈逐渐上升趋势。BCG组IFN-γ量在免疫后8~10周达到最高峰,12周时IFN-γ量降至100pg/mL。rBCG-12组8周时IFN-γ的量上升到约为200pg/mL,之后仍继续增加,10周时达最高峰,约为350pg/mL,12周时IFN-γ的量约为250pg/mL,明显高于BCG组(P<0·05)。而各时间点各组IL-4产生水平均不明显,BCG组与rBCG-12间P>0·05。结论:rBCG-12免疫后能明显改善机体免疫反应向Th1型极化,产生高水平的细胞免疫反应,而其对体液免疫反应有抑制的趋势,有利于机体抵抗结核菌感染。     

重组卡介苗的研究进展

卡介苗（BCG）不仅是目前预防结核病的有效疫苗，而且随着人们对其生物遗传学性质的深入研究证实，许多外源基因都可在BCG中获得表达且具有较好的免疫效果。利用BCG表达外源基因制备重组卡介苗在预防及治疗疾病方面具有潜在的应用前景。     

结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。     

人细胞因子IL-12p70与结核分枝杆菌特异性抗原Ag85A融合基因重组卡介苗的构建及鉴定

目的:构建可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A的重组卡介苗,为结核病新疫苗的研制奠定基础.方法:以穿梭表达质粒pMV361为载体,构建重组质粒rpMV361-IL-12p70-Ag85A.将成功构建的重组质粒以电转化方式导入BCG基因组构建重组卡介苗rBCG-IL-12p70-Ag85A.通过抗生素筛选、重组卡介苗基因组PCR扩增及测序,以及western-blotting对重组卡介苗进行鉴定.结果:经鉴定,重组卡介苗成功构建,并可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A.结论:重组卡介苗rBCG-12p70-Ag85A构建成功,并可高效表达目的蛋白.     

四种卡介苗重组疫苗对结核病的预防作用

目的:评价esat6-卡介苗重组疫苗、mpt64-卡介苗重组疫苗、ag85a-卡介苗重组疫苗、ag85b-卡介苗重组疫苗对结核病预防效果.方法:观察四种卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防试验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、T细胞及B细胞免疫功能等指标.结果:卡介苗重组疫苗及卡介苗与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率.其中esat6-卡介苗重组疫苗组效果最显著,与卡介苗组比差异有统计学意义.实验结束时,esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脏器大体病变较其他各组轻.脏器结核分枝杆菌培养结果表明:esat6-卡介苗重组疫苗组小鼠脏器内结核分枝杆菌较少,其他各组闻无显著区别.抗体检测结果表明,ag85a-卡介苗重组疫苗免疫小鼠抗体水平显著升高,其他各组之间无差别.淋巴细胞增殖实验结果,各组之间差异无统计学意义.结论:初步实验结果表明esat6-卡介苗重组疫苗对结核菌的预防作用强于卡介苗.     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

结核杆菌Hsp65和Esat-6基因共表达质粒的构建和表达

目的：构建pIHsp65-Esat6双顺反子真核表达质粒并在真核细胞中表达，以进一步了解两者共同表达在体内的免疫保护力。方法：实验于2006-12／2007-05在暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室完成。以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模扳经聚合酶链反应分别扩增出Hsp65和Esat-6基因，分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A和B中，构建pIHsp65-Esat6真核表达质粒，并转染HepG-2细胞中表达和检测。结果：酶切鉴定提示插入的基因片段分别为1．64kb和0．31kb，测序分析表明克隆的Hsp65和Esat6序列与GenBank上公布序列完全一致；反转录-聚合酶链反应分别检测到Hsp65和Esat-6两基因mRNA转录，表达的蛋白Mr分别为65000和10500。结论：成功构建和表达pIHsp65-Esat6质粒。     

2011-2018年四川省自贡市分枝杆菌临床分离株鉴定分析

目的了解自贡市肺部感染分枝杆菌的菌种菌型特征,为临床分枝杆菌病的诊断和治疗及制定有效防控策略提供科学依据。方法收集2011-2018年临床疑似结核病患者分离到的抗酸染色阳性培养物,经对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴别培养和多位点PCR鉴定为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(NTM),再经rpoB和hsp65序列分析对NTM进行种的鉴定。结果 2 751株分枝杆菌临床分离株经PNB/TCH鉴别培养基和多位点PCR鉴定,结核分枝杆菌2 647株,占96.22%,非洲分枝杆菌Ⅰ型32株,占1.16%,NTM 72株,占2.62%。72株NTM鉴定出11个种。结论自贡市分枝杆菌肺部感染主要为结核分枝杆菌所致,感染致病的NTM种类较多,以脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。外来分枝杆菌和奥巴涅分枝杆菌在国内为首次报道。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

pcDNA-GPC3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类GPC3重组真核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因序列,应用T克隆载体及pcDNA真核表达载体重构,将质粒转化进入HLE人肝癌细胞系,进行荧光免疫方法检测。结果 测序结果序列正确,荧光染色转染质粒的HLE细胞可见细胞浆和细胞膜上有GPC3的表达。结论成功构建真核表达载体pcDNA-GPC3,并在真核细胞中可以表达。     

携带Bcl-xl基因的重组慢病毒的制备和鉴定

目的制备携带Bcl-xl基因的重组慢病毒,并鉴定其感染细胞有效性。方法从本所以前构建的重组质粒pAAV-Bcl-xl获得Bcl-xl基因的编码序列,将其置换掉慢病毒质粒pSin-EF2-SOX2-Pur中的SOX2基因编码序列,从而得到重组慢病毒质粒pSin-EF2-Bcl-xl-Pur。然后利用这一质粒包装制备了携带Bcl-xl基因的重组慢病毒颗粒,用其感染细胞后用Western blot和流式检测仪分析了感染前后细胞中Bcl-xl基因的表达情况。结果感染后细胞中Bcl-xl蛋白的表达水平显著高于感染前。结论携带Bcl-xl基因的重组慢病毒颗粒包装成功,能高效感染细胞,为后续的遗传改造树突细胞打下了基础。     

IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人白细胞介素31(IL-31)重组腺病毒Ad-IL-31,为下一步IL-31功能研究奠定基础.方法 以pGEM-T-IL-31为模板扩增IL-31基因,将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架质粒共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-31,经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞,荧光显微镜下观察细胞内荧光,测定病毒效价,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(western blot)分析细胞内IL-31信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质的表达.结果 经双酶切及基因扩增仪鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见500 bp插入片段,测序结果和基因库中的基因序列一致;重组病毒效价为2.6×108 pfu/ml;重组病毒感染后,QBI-293A细胞中有IL-31mRNA和蛋白质表达.结论 成功构建IL-31重组腺病毒载体,并在QBI-293A细胞中表达,为进一步研究IL-31的功能奠定了基础.     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定

背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.     

大鼠组织激肽释放酶8重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建大鼠组织激肽释放酶8（KLK8）的腺病毒表达载体,为进一步研究KLK8对心肌细胞的作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性KLK8编码基因的重组腺病毒载体pAd-KLK8,转染AD-293细胞包装产生重组腺病毒Ad-KLK8,TCID50法对收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR及Western-blot方法检测目的基因在Hela细胞的表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实KLK8基因正确插入腺病毒表达载体,并在AD-293细胞中包装出重组腺病毒;收获病毒的滴度为3.16×1012 IU/mL。结论成功构建pAd-KLK8重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效表达。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

人Hiwi miRNA干扰质粒的构建及其鉴定

目的构建人Hiwi基因miRNA干扰质粒,探讨其对肝癌7721细胞株中Hiwi基因和蛋白表达的阻抑作用。方法根据Homo sapiens Hiwi基因序列,设计RNA干扰靶点,构建4对Hiwi的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒并将其转染至肝癌7721细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测7721细胞中HiwimRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了4对Hiwi miRNA干扰质粒及无效干扰质粒,测序表明Hiwi干扰序列及读框完全正确。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组及阴性对照组比较,转染该载体能有效下调7721细胞株中mRNA和蛋白的表达。结论成功构建了Hiwi的干扰表达载体,为进一步探讨Hiwi基因在肝癌中的相关机制提供了实验基础。