缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的 :发现并克隆缺血再灌可诱导基因。方法 :应用mRNA差异显示技术 ,在猪的心肌组织 ,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段 ,随后筛选猪心脏cDNA文库。经克隆、测序、杂交后 ,分析克隆基因的基本特性。结果 :发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段 ,通过筛选cDNA文库获得一个编码 6 0 8个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因、蛋白质氨基酸均无同源性。Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高 ,并且在正常猪的心、肝、肺、肾、脾、肠、脑和骨骼肌组织均可检测到其表达。Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性。结论 :克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因 ,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

两个缺血再灌可诱导新基因的表达与克隆

目的：发现和克隆短暂缺血再灌注心肌组织内mRNA表达发生改变的基因。方法：反复短暂结扎猪左冠状动脉前降支引起缺血再灌，从受累心肌组织中提取RNA并用于mRNA差异显示。经克隆和测序其cDNA序列后，用Northern杂交进一步证实其表达。结果：克隆并确证两个cDNA（即W12和W28）为真正差异表达。它们在缺血再灌心肌中的表达明显高于非缺血的心肌，W12，W28表达水平分别为非缺血心肌的2．0倍（P＜0．05）和1．9倍（P＜0．05）。另外，在猪心脏、肝、肺、肾、脾、肠、脑、骨骼肌等组织器官均可检测到它们的mRNA。DNA序列分析显示，该两个cDNA与已知基因均无同源性，表明它们代表新的基因。结论：发现和克隆到两个缺血再灌可诱导的新基因。     

两个缺血再灌可诱导新基因的表达与克隆

目的 :发现和克隆短暂缺血再灌注心肌组织内mRNA表达发生改变的基因。方法 :反复短暂结扎猪左冠状动脉前降支引起缺血再灌 ,从受累心肌组织中提取RNA并用于mRNA差异显示。经克隆和测序其cDNA序列后 ,用Northern杂交进一步证实其表达。结果 :克隆并确证两个cDNA(即W12和W2 8)为真正差异表达。它们在缺血再灌心肌中的表达明显高于非缺血的心肌 ,W12 ,W2 8表达水平分别为非缺血心肌的 2 0倍 (P <0 0 5 )和 1 9倍 (P <0 .0 5 )。另外 ,在猪心脏、肝、肺、肾、脾、肠、脑、骨骼肌等组织器官均可检测到它们的mRNA。DNA序列分析显示 ,该两个cDNA与已知基因均无同源性 ,表明它们代表新的基因。结论 :发现和克隆到两个缺血再灌可诱导的新基因     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的：采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库。方法：以食管癌组织为测试子（tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子（driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管消减cDNA文库。结果：用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R 的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论：构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

梅花鹿两个管家基因部分 cDNA序列的克隆

目的 :开发吉林双阳梅花鹿的基因资源 ,在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 :从鹿脾脏细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,构建 c DNA质粒文库 ,从中克隆 2个管家基因并进行序列分析。结果 :成功克隆的管家基因的一个核酸序列及其对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠蛋白酶体 α3型亚单位 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源 ;另一个管家基因的序列及对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠转录激活因子 - 4部分 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源。结论 :新发现的双阳梅花鹿蛋白酶体α3型亚单位部分 c DNA序列和转录激活因子 - 4部分c DNA序列 ,已在 Genbank中登录 ( BG67371 3,BG67371 4 )。     

小鼠β趋化因子受体CCR5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂ ｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂ ｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｍ方法检测分析该ＡＤＬＤ，Ｎｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，     

人肿瘤坏死因子样蛋白全长cDNA的克隆及原核表达

目的分离、克隆编码人肿瘤坏死因子样蛋白(TNFLP)的全长cDNA,并对其功能进行初步研究。方法从本室构建的λZAP表达胎脑文库中分离到编码TNFLP的全长cDNA。应用多种软件对该基因及其编码蛋白进行分析,寻找其同源蛋白,分析其亲、疏水性及其存在的结构域和基序。以Northern印迹分析检测TNFLP的mRNA的组织分布,并用谷胱苷肽-S-转移酶(GST)原核表达系统分段表达TNFLP的N端和C端蛋白。结果TNFLP全长共2112bp,编码一208个氨基酸的蛋白。亲、疏水性分析显示,TNFLP有两个疏水区,且C端95个氨基酸与小鼠的TNF-α一致性为42%。基序分析显示,TNFLP的C端有一内质网膜定位信号-TYKRL,与TNF-α完全一致。人的TNFLP位于人的16号染色体上。Northern杂交显示,TNFLP在心、脑和胰腺中呈高表达,可见一个转录本。用GST原核表达系统,分段表达了TNFLP的N端和C端。结论初步分析了TNFLP的组织表达谱,并分段表达了其N端和C端,为进一步研究其功能提供了条件。     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

Differential screening captopril responsive genes in the heart of spontaneously hypertensive rats

Cedac h~ or remodeling is closely "dated tothe development Of caliliac failare in essenhal hnyrtension. There is abundant evidence that ~-angiotensinsystem Plays a crucial I'Ole in the cedac remedeling. Administlation of mpotenSin converting enZyTne (ACE) inhibitoIS can efficiendy prevent the cabal hypeltIDPhy inhUInan and experimental hypertenSion[". The ~ndousefficiency Of ACE ~tor in treatment of cedovasculardiseases was kllown as itS diVerse mechanisms such as inhibition of angio…     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。