恶性疟原虫HT1基因荧光真核表达载体的构建及细胞内表达

目的　体外扩增恶性疟原虫海南分离株的已糖转运体基因 (pfHT1) ,构建恶性疟原虫HT1基因真核融合表达载体并检测其表达情况 ,为用于DNA免疫作准备。方法　特定PCR引物的设计 ,扩增 ,基因组DNA提取 ,连接 ,鉴定 ,细胞培养 ,脂质体转染 ,荧光显微镜观察。结果　从恶性疟原虫海南分离株基因组DNA中扩增特异的编码 pfHT1的基因序列 ,片断大小为 15 16bp ,经酶切鉴定证实成功构建 pEGFP -HT1融合表达质粒 ,将其转染体外培养的细胞后 ,可见融合蛋白表达产生的明亮的绿色荧光。结论　成功构建 pEGFP -HT1融合表达质粒 ,并实现在细胞内的表达。为进行动物体内的DNA免疫打下了基础。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的 构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达.方法 根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆.对经PCR、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的 片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证.脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT-PCR验证该基因的表达.结果 PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT-PCR的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达.结论 成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备.     

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RT-PCR方法，克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段，并将其与T载体连接，测序证实无误后，用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体，然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点，最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2（-）。     

NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达

目的构建核呼吸因子-1（NRF-1）基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）。方法：利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6．3-NRF-1．IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）,然后用杀稻瘟素（blasticidin）筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果：收集的重组慢病毒滴度为5．5×10^7TU／ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2．25倍。结论：本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2（2-1）中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

APP基因真核表达载体的构建与鉴定

目的重组ＡＰＰ基因真核表达载体。方法采用定向克隆技术、脂质体转染和Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ杂交技术。结果在分别独立的反应中,ＰＤＧＦ启动子、ＡＰＰｃＤＮＡ、载体依摩尔比３∶３∶１及１∶１∶１同时连接,重组体利用脂质体介导转染ＳＹ５Ｙ神经母细胞瘤细胞,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｏｌｔ杂交检测到瞬时表达。结论构建具有神经组织特异性的ＡＰＰ基因真核表达载体。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

MAGE-3目的基因真核表达载体的构建

目的构建黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）目的基因真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3.方法用RT-PCR法从肝癌组织制备含BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pcDNA3.1载体上,根据氨苄青霉素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、引物扩增等方法筛选、鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列MAGE-3目的基因进行DNA测序.结果扩增出MAGE-3目的基因;重组质粒pcDNA3.1-MAGE-3中的插入片段经DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较,结果完全一致.结论成功构建了真核重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-3,为肿瘤免疫治疗提供了条件.     

APP基因真核表达载体的构建与鉴定

目的重组APP基因真核表达载体。方法采用定向克隆技术、脂质体转染和Nonhenblot杂交技术。结果在分别独立的反应中,PDGF启动子、APPcDNA、载体依摩尔比3∶3∶1及1∶1∶1同时连接,重组体利用脂质体介导转染SY5Y神经母细胞瘤细胞,Northernbolt杂交检测到瞬时表达。结论构建具有神经组织特异性的APP基因真核表达载体。     

人Dact2基因真核表达载体的构建及其在结肠癌细胞中的表达

目的构建人Dact2基因真核表达载体。方法以人胎肝cDNA文库为模板,利用RT—PcR方法获得Dact2编码序列,构建并鉴定表达Dact2的pcMV6-Entry—GFP真核表达载体。Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞株HT29,荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析转染效率,westernblot检测Dact2蛋白表达。结果通过PcR扩增获得了2322bp的Dac￡2编码序列,通过酶切及测序证实Dact2序列正确插入真核表达载体pcMV6-Entry—GFP;转染空载体和Dact2表达质粒48h后,荧光显微镜下观察,可见两组细胞均表达绿色荧光蛋白,流式细胞仪分析结果显示瞬时转染效率分别为41．36％和39．88％。Western blot检测证实转染表达质粒组的细胞Dact2蛋白呈阳性表达。结论成功构建了人Dact2真核表达载体,为其功能研究奠定了基础。     

MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究

目的克隆人类MxA基因,探索其细胞内直接抗HBV作用,以便寻求HBV及其他病毒感染的新的基因治疗靶点。方法以pHMG—MxA质粒载体为基础,构建人类MxA基因表达质粒,采用人HBV—DNA转染的2．2．15细胞株作为研究对象,以不同浓度的MxA基因转染进行干预培养,lamivudine（3TC）阳性对照,同时设立空白对照,观察对HBV表达和复制的影响。结果经过酶切鉴定证明重组MxA基因表达质粒pcDNA—MxA构建正确,转染2．2．15细胞后呈现出明显抑制HBV复制和表达作用,且与转染剂量有关;3TC组也见MxA的表达增高,HBV—DNA复制受到明显抑制。结论抗病毒基因MxA具有细胞内抗HBV的复制及抑制病毒抗原基因的表达作用。     

结核杆菌Rv0901基因真核表达质粒的构建及在细胞内的表达与鉴定

目的构建结核杆菌Rv0901基因的真核表达质粒并进行表达,为研究Rv0901基因的功能提供材料。方法以结核杆菌基因组DNA为模板PCR扩增Rv0901基因序列,将Rv0901基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）获得重组表达质粒,体外转染Cos7细胞,RT-PCR检测转染的情况,并提取转染细胞总蛋白和收集细胞培养液上清检测蛋白的表达,Western-blotting检测蛋白表达的特异性。结果成功扩增出Rv0901基因序列,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Rv0901,重组质粒转染细胞后的RT-PCR能扩增出Rv0901基因序列,转染细胞总蛋白和细胞培养液上清均能特异表达Rv0901基因蛋白。结论成功构建Rv0901基因真核表达质粒并在真核细胞内进行了良好表达,为研究该基因功能打下了坚实基础。     

FGF2基因真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的研究真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-FGF2(成纤维细胞生长因子2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达及其对MSCs的影响。方法基因克隆构建pcDNA3．1／V5-His-FGF2真核表达载体,利用FuGENETM6转染大鼠MSCs,RT-PCR、免疫荧光检测其表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测其对MSCs生物学活性的影响。结果构建了含FGF2基因的真核表达载体;RT-PCR证实外源FGF2基因可转染到MSCs;免疫荧光检测转染24 h即可在MSCs中表达;MTT法检测转染48、72 h后细胞吸光度值(0．3871±0．0433、0．4349±0．0319)明显高于空载体组(0．3457±0．0162、0．3881±0．0434)(t1=2．833、t2=2．313,P<0．05)和未转染组(0．3378±0．0215、0．3641±0．0365)(t1=3．227、t2=3．650,P<0．05),而空载体对细胞增殖无影响(P> 0．05)。结论构建了FGF2真核表达质粒,并在MSCs中成功表达,为FGF2基因治疗的研究奠定了坚实的基础。