雷帕霉素对人淋巴瘤Raji细胞增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响

目的:探讨雷帕霉素对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响及其临床意义.方法:不同浓度(0、10、50、100、250、500nmol/L)雷帕霉素对Raji细胞作用不同时间(24、48、72h)后,使用CCK8法检测细胞增殖的变化;采用蛋白质印记法(Western blot,WB)检测72h组不同浓度mTOR、VEGF-A、HIF-1α蛋白变化;采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测其mRNA的变化.结果:雷帕霉素对Raji细胞增殖具有显著抑制作用(P＜0.01);雷帕霉素处理72h后的Raji细胞,随着药物浓度增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1 α蛋白明显减少(P＜0.01);雷帕霉素处理后的Raji细胞,随着药物浓度和作用时间的增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1α的mRNA明显减少(P＜0.01);mTOR、VEGF-A及HIF-1α的mR-NA表达两两之间呈正相关性.结论:雷帕霉素通过mTOR通路,能明显抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖过程,表现出明显的时间、剂量效应依赖关系;同时也可明显减少mTOR、VEGF-A、HIF-1α的mRNA的转录表达,减少p-mTOR、VEGF-A、HIF-1α等蛋白的翻译表达,从而抑制Raji细胞的生长及其血管新生.     

胃癌细胞SGC7901凋亡的PI3K/Akt通路介导作用及雷帕霉素的作用机制分析

目的：分析雷帕霉素对胃癌细胞中PI3K/Akt蛋白表达的影响作用,以为临床治疗提供参考。方法将生长状态良好的胃癌细胞SGC7901随机分为4组：对照组,雷帕霉素低剂量组、中剂量、高剂量组（n=8）。采用DAPI染色法分析各组细胞的凋亡情况;采用免疫印迹法和Real-time PCR检测PI3K/AKT信号通路中相关蛋白PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表达。结果雷帕霉素低、中、高剂量组均可抑制细胞的增殖,差异具有统计学意义（P﹤0.05）;雷帕霉素下调了胃癌细胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表达,且与对照组比较,差异均有统计学意义（P﹤0.05）。结论雷帕霉素主要通过抑制PI3K、AKT及mTOR的过表达发挥肿瘤抑制作用。     

雷帕霉素抑制胆囊癌GBC-SD细胞的生长和转移

目的：研究雷帕霉素 (rapamycin) 对胆囊癌GBCSD细胞生长和转移的影响,探讨雷帕霉素治疗胆囊癌的临床应用前景。方法:采用MTT法检测不同浓度（12.5、25、50 nmol/L）的雷帕霉素对胆囊癌细胞增殖的影响,以流式细胞术检测不同浓度的雷帕霉素对细胞凋亡和细胞周期的变化,Transwell小室检测雷帕霉素对细胞迁移能力的影响,利用Western blotting检测胆囊癌细胞中雷帕霉素哺乳动物靶标（mammalian target of rapamycin,mTOR）及其磷酸化pmTOR水平。结果:雷帕霉素可显著抑制胆囊癌GBCSD细胞中mTOR的磷酸化,但对mTOR表达无影响。雷帕霉素显著抑制胆囊癌细胞的生长,并呈剂量依赖性抑制(P<0.01)。雷帕霉素可引起胆囊癌细胞周期G1/S阻滞和细胞凋亡;可显著抑制胆囊癌细胞的转移(P<001)。结论:雷帕霉素能显著抑制胆囊癌细胞生长及转移,其机制可能与抑制pmTOR通路、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。     

丙戊酸促进神经母细胞瘤细胞自噬性死亡

目的探讨丙戊酸(VPA)对神经母细胞瘤细胞自噬性死亡的调控。方法用含不同浓度的VPA培养基培养SH-SY5Y细胞,应用MTT法检测细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞损伤,单丹磺酰尸胺(MDC)染色评价细胞质内酸性自噬泡的形成,Western blotting法检测巨自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达。结果与对照组比较,VPA孵育48 h后,SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性(P<0.05);SH-SY5Y细胞培养基中LDH明显增高,且具有剂量依赖性(P<0.05);VPA诱导细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 VPA诱导神经母细胞瘤细胞细胞自噬性死亡,为神经母细胞瘤的治疗提供新的手段。     

mTOR信号通路与非小细胞肺癌放疗敏感性的关系

目的:研究mTOR信号通路与非小细胞肺癌放疗敏感性的关系。方法:采用不同剂量的雷帕霉素抑制非小细胞肺癌细胞系A549中的mTOR信号通路;Western blot检测雷帕霉素作用后下游信号分子的表达;将A549细胞分为空白对照组及雷帕霉素作用的实验组,将对照组和实验组经不同剂量射线作用;用MTT实验（噻唑蓝）及克隆形成能力检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果:雷帕霉素药物作用抑制了mTOR信号通路及下游分子的表达,经不同剂量射线照射后细胞的增殖能力和克隆形成能力显著低于对照组,凋亡显著高于对照组。结论:抑制mTOR信号通路可以增加非小细胞肺癌对放疗的敏感性。     

调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响

目的:探究调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响。方法:取对数生长期的宫颈癌SiHa细胞加入不同浓度的TGF-β1和SIS3干预24小时后收取细胞,采用实时荧光定量PCR法及免疫印迹法检测自噬基因LC3在mRNA水平及蛋白水平上的表达量变化。结果:不同浓度的TGF-β1作用SiHa细胞24小时后,随TGF-β1浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐增高（P＜0.05）。不同浓度的SIS3作用SiHa细胞24小时后,随SIS3浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐降低（P＜0.05）。结论:外源性的TGF-β1/Smad4通路激活剂TGF-β1可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量升高,诱导宫颈癌SiHa细胞发生自噬;外源性的TGF-β1/Smad4通路抑制剂SIS3可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量降低,抑制宫颈癌SiHa细胞发生自噬;且随TGF-β1和SIS3浓度的增加,LC3的表达量出现变化,具有一定的浓度依赖性。     

2,3-吲哚醌诱导成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡过程中部分凋亡调控基因的变化

目的:研究2 ,3-吲哚醌(2, 3-dioxoindoline, isatin,ISA)诱导人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的分子机制.方法:体外培养人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,将SH-SY5Y细胞随机分为对照组和ISA不同浓度(100、200和400 μmol/L )处理组,采用Hoechst 33258荧光染色、DNA ladder分析细胞凋亡,RT-PCR检测不同浓度ISA处理后基因VEGF、bcl-2、 bax、survivin及p53在mRNA水平上表达的变化,FCM法检测caspase-3蛋白表达的变化.结果:不同浓度的ISA(0、100、200和400 μmol/L)作用SH-SY5Y细胞48 h后,在荧光显微镜下观察到400 μmol/L ISA组细胞出现典型的凋亡形态学改变:细胞核染色质聚集、碎裂,细胞质浓缩;琼脂糖凝胶电泳显示400 μmol/L ISA处理组细胞出现明显的梯状条带.RT-PCR结果显示:随着ISA作用浓度的增加,bcl-2、VEGF和survivin mRNA的表达均逐渐减少(P<0.05),bax mRNA表达水平未见明显变化(P>0.05) ;而随着ISA浓度的增加, p53 mRNA表达水平逐渐增加(P<0.05),并呈浓度依赖关系.FCM结果显示,随着ISA作用浓度的增加,活化的caspase-3蛋白表达率分别为18.38%、26.93%和35.66%,明显高于对照组的11.23%(P<0.05).结论:ISA能明显诱导SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与ISA促进p53 mRNA转录、抑制bcl-2和survivin mRNA转录以及使细胞内活化的caspase-3蛋白水平增加有关.另外,ISA能抑制VEGF mRNA转录,对抑制肿瘤生长及转移有重要意义.     

雷帕霉素联合缺氧诱导肺腺癌A549细胞凋亡及其分子机制

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶向(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路抑制剂雷帕霉素联合缺氧诱导人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的分子机制.方法:应用雷帕霉素联合缺氧处理人肺腺癌细胞株A549后,Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡情况,实时定量PCR和Western印迹法分别检测A549细胞中survivin mRNA和蛋白的表达变化,Western印迹法检测缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF1α)表达的改变.结合染色质免疫共沉淀技术,探讨雷帕霉素通过诱导细胞凋亡而发挥抗肺癌效应的分子机制.结果:雷帕霉素联合缺氧可在体外诱导A549细胞凋亡,雷帕霉素联合缺氧可诱导A549细胞中survivin mRNA(P＜0.01)和蛋白的表达水平明显下调.雷帕霉素通过抑制缺氧条件下诱导的HIF-1α表达增加,进而抑制survivin的表达.结论:雷帕霉素通过抑制缺氧条件下A549细胞中HIF-1α的表达,降低HIF-1α与survivin核心启动子的结合,下调缺氧引发的凋亡抑制基因survivin表达,进而发挥抗肿瘤的生物学效应.     

mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

目的观察mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。方法选取45例喉鳞状细胞癌组织和45例正常喉黏膜组织,采用免疫组织化学法检测mTOR蛋白的表达;将喉鳞状细胞癌Hep-2细胞分为空白对照组、空载体组和mTOR siRNA组,及正常对照组、溶剂对照组和雷帕霉素组,分别利用mTOR siRNA和雷帕霉素进行治疗,采用Western bloting法检测不同浓度的mTOR siRNA和雷帕霉素分别处理细胞后对mTOR蛋白表达的影响,并采用CCK-8试剂盒分析mTOR蛋白表达下调对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。结果 mTOR蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于正常喉黏膜组织(P<0.05)。3种不同浓度mTOR siRNA分别转染Hep-2细胞24、48、72 h,各组与空白对照组、空载体组相比,mTOR蛋白表达均有所降低(P<0.05),且mTOR蛋白表达随mTOR siRNA浓度的增加、作用时间的延长而降低(P<0.05)。3种不同浓度雷帕霉素处理Hep-2细胞24、48、72 h,各组与溶剂对照组及正常对照组相比,mTOR蛋白表达量均有所降低(P<0.05);且mTOR蛋白表达随雷帕霉素浓度的增加、处理时间的延长而降低(P<0.05)。与空白对照组、空载体组相比,各mTOR siRNA组的Hep-2细胞增殖在转染后24、48、72 h均受到明显抑制(P<0.05)。结论 mTOR siRNA均能降低喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中mTOR蛋白的表达,有效抑制细胞的生长,为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供了理论依据。     

国产雷帕霉素对人淋巴瘤细胞Raji增殖的影响

目的探讨国产雷帕霉素（宜欣可）对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外生长及对mTOR/p 70S6K信号通路的影响。方法MTT法检测不同浓度（0、1、5、10、20、40、50、100 nmol/L）国产雷帕霉素作用不同时间（24、48、72 h）对Raji 细胞增殖的影响。光学显微镜观察Raji细胞形态学变化。流式细胞仪测定国产雷帕霉素对Raji细胞周期分布和凋亡的影响。Western blot 方法检测国产雷帕霉素处理前后对Raji 细胞mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的影响。结果国产雷帕霉素对Raji细胞增殖有明显的抑制作用（不同浓度P<0.01或P<0.05）,呈现明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。国产雷帕霉素明显抑制Raji细胞周期发展（P<0.05）,但没有发生明显的凋亡（P>0.05）。0、10、50、100 nmol/L国产雷帕霉作用于Raji细胞的mTOR、p-p70S6K,其蛋白量随药物浓度增大而降低（P<0.05）,p70S6K随药物浓度增大而升高（P<0.05）。结论人淋巴瘤细胞株Raji中存在mTOR/p70S6K信号通路激活状态,宜欣可可抑制该通路激活并通过阻滞细胞周期发展抑制Raji细胞增殖。     

小白菊内酯对人甲状腺癌细胞BCPAP增殖及自噬的影响

目的:研究小白菊内酯对人甲状腺癌BCPAP细胞的增殖以及自噬水平的影响。方法:通过MTS法检测不同药物浓度的小白菊内酯对BCPAP细胞增殖的作用。倒置显微镜观察不同给药浓度时细胞的形态变化。免疫荧光技术检测LC3的表达情况。Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ与Beclin1的变化。结果:小白菊内酯可以抑制BCPAP的增殖，呈时间与剂量依赖性。随着给药浓度的增加，细胞数量逐渐减少，且形态逐渐改变，细胞皱缩、变圆、透亮，能够反映细胞LC3表达的红光逐渐增强。 Western Blot结果显示，LC3Ⅱ与Beclin1的表达均随着给药浓度的增加而增加。结论:小白菊内酯可以提高甲状腺癌BCPAP细胞的自噬水平，且显著抑制细胞的增殖，呈时间与剂量依赖性。     

雷帕霉素对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的：观察雷帕霉素（rapamycin，rapa）对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR／p70S6K信号通路的影响。方法：采用免疫细胞化学证实mTOR／p70S6K信号通路的存在，然后通过DNALadder、RT—PCR、Westernblot及流式细胞术分别从DNA、RNA、蛋白及细胞水平研究rapa对细胞凋亡和信号通路的影响。结果：免疫细胞化学结果显示，在细胞核及细胞质中mTOR均呈阳性；rapa处理后有明显DNALadder产生，且mTOR的mRNA水平及蛋白水平下调。但是，mTOR下游的直接靶点p70S6K的mRNA水平及蛋白水平则升高，二者的变化程度均与rapa剂量的相关；流式细胞术检测结果表明，rapa可使细胞停滞于G1期。结论：食管鳞癌细胞系EC9706中存在mTOR／p70S6K信号通路并且处于激活状态，rapa能明显促进细胞凋亡并抑制该通路激活，从而间接抑制翻译的进行。     

Erufosine simultaneously induces apoptosis and autophagy by modulating the Akt-mTOR signaling pathway in oral squamous cell carcinoma

We investigated the anticancer activity of erufosine in oral squamous carcinoma cell lines in terms of cell proliferation, colony formation, induction of autophagy/apoptosis, cell cycle and mTOR signaling pathway. Erufosine showed dose-dependent cytotoxicity in all cell lines, it induced autophagy as well as apoptosis, G2 cell cycle arrest and modulation of cyclin D1 expression. Further erufosine downregulated the phosphorylation of major components of mTOR pathway, like p-Akt at Ser473 and Thr308 residues, p-Raptor, p-mTOR, p-PRAS40 and its downstream substrates p-p70S6K and p-4EBP1 in a dose-dependent manner. The pre-treatment of tumor cells with p-mTOR siRNA increased cytotoxic effects of erufosine comparable to cisplatin but higher than rapamycin.     

柴胡皂苷d通过AKT/mTOR信号通路调控胶质瘤C6细胞自噬

目的 探讨柴胡皂苷d在胶质瘤C6细胞自噬中的作用及其机制。方法 分别以终浓度为0 μmol/L（Control组）、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L的柴胡皂苷d作用胶质瘤C6细胞后,用CCK⁃8检测细胞增殖能力,后续分别采用克隆形成实验、划痕实验检测柴胡皂苷d（8 μmol/L）对胶质瘤C6细胞增殖能力和细胞迁移能力的影响,Western blot和qRT⁃PCR检测胶质瘤C6细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和AKT/mTOR信号通路相关蛋白及基因的表达情况。结果 与Control组比较,各浓度柴胡皂苷d均能抑制胶质瘤C6细胞增殖且增殖抑制率随着药物浓度的升高而升高（均P<0.01）。8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后,与Control组比较,胶质瘤C6细胞的克隆形成数目显著减少［（479.33±30.66）个 vs （258.66±73.35）个,P<0.01］,细胞迁移率显著降低［（70.83±4.29）% vs （19.47±1.71）%,P<0.001］,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的蛋白及mRNA表达水平均显著升高（均P<0.01）,而AKT和mTOR信号蛋白及mRNA表达水平均降低（均P<0.01）。结论 柴胡皂苷d可能通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导胶质瘤C6细胞发生自噬并抑制其增殖与迁移。     

熊果酸对胃癌细胞株MGC-803 凋亡和自噬的调控及其作用机制

[摘要] 目的:观察熊果酸(UA)对胃癌细胞株MGC-803 自噬和凋亡的调控作用,并探讨UA基于PI3K/AKT/mTOR信号通路诱发MGC-803 细胞自噬的机制。方法:体外培养人胃癌细胞株MGC-803,分为空白对照组、UA干预组和UA+3-MA组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染细胞法检测各组细胞自噬发生情况,qPCR实验检测各组细胞LC3B、BAX、Bcl-2 mRNA的表达水平,WB实验检测各组细胞Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1、LC3B、BAX、Bcl-2 蛋白的表达水平。结果: 与空白对照组相比,UA干预组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染法显示,与空白对照组相比,UA 干预组绿色和红色荧光亮点数均显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组绿色和红色荧光亮点数均显著减少（P<0.05）。qPCR和WB实验结果显示,与空白对照组相比,UA干预组BAX和LC3B mRNA和蛋白以及ULK1 蛋白表达水平均显著上调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平以及Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著下调（均P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组BAX、LC3B mRNA和蛋白表达水平显著下调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平显著上调（均P<0.05）,Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR 和ULK1 蛋白表达水平无显著差异（P>0.05）。结论: UA诱导的自噬可以促进胃癌细胞MGC-803 的凋亡,其机制可能与UA参与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达有关。     

Rapamycin provides a therapeutic option through inhibition of mTOR signaling in chronic myelogenous leukemia

Chronic myelogenous leukemia (CML) is a neoplasm of myeloid progenitor cells expressing Bcr-Abl fusion protein. However, some patients with CML are less likely to respond to imatinib, the inhibitor of Bcr-Abl kinase. Recent studies showed that mTOR pathway can increase responses to imatinib. The analysis of mTOR pathway in CML may provide new insights into possible targets of novel therapies. Therefore, we examined the expression of mTOR pathway molecules in bone marrow cells from CML patients and effect of rapamycin on K562 cells in?vitro. Western blot analysis showed the visibly higher phosphorylation of mTOR (70.6%), 4E-BP1 (76.5%) and p70S6K (73.5%) in bone marrow cells from CML patients. Moreover, treatment of CML cell line (K562) with rapamycin resulted in a decrease of phosphorylation of mTOR, 4E-BP1 and p70S6K. In?vitro, the cell viability in groups with rapamycin treatment displayed a significant decrease in a dose-dependent manner by MTT. The data presented an increase of G0/G1 phase cells and decrease of S phase cells after rapamycin treatment, and the decreased expression of cyclinD1, higher expression of p21 at mRNA level was also detected in K562 with rapamycin. Treatment with 20 nmol/l or more rapamycin could increase apoptotic cells, decrease expression of bcl-2 and activate caspase-3. In conclusion, the mTOR pathway might be involved in chronic myelogenous leukemia. Inhibition of mTOR pathway could interfer with cell proliferation and increase cell apoptosis in K562 cells. It suggested that mTOR might be an important therapeutic target for myelogenous leukemia.     

EBSS饥饿人鼻咽癌CNE-2细胞株诱导自噬的机制研究

目的:观察饥饿状态下永生化正常鼻咽上皮NP69细胞、鼻咽癌CNE-2细胞的自噬变化及自噬与凋亡的相互作用,为Baf-A1在鼻咽癌中的应用前景提供证据。方法:EBSS溶液替代DMEM溶液在NP69和CNE-2细胞中制造体外饥饿环境,Baf-A1抑制细胞自噬。应用Western blot及透射电镜检测细胞自噬,MTT检测细胞存活率,qRT-PCR检测mRNA表达。结果:与NP69细胞相比,EBSS制造的饥饿环境显著促进CNE-2细胞发生自噬,处理24时后出现大量细胞凋亡,100 nmol/L Baf-A1抑制细胞自噬可延缓饥饿诱导的细胞凋亡。qRT-PCR检测结果:EBSS作用下,LKB1、AMPK、ULK1、Beclin1、ATG5 mRNA水平均显著上升(P<0.05)。结论:EBSS通过LKB1/AMPK/mTOR通路显著诱导CNE-2细胞自噬的发生。     

Prucalopride通过促进自噬抑制胶质瘤细胞U251增殖

目的:研究Prucalopride对胶质瘤U251细胞增殖、自噬、凋亡的影响,并探讨其相关信号通路。方法:通过CCK8检测细胞增殖的变化;Transwell检测迁移和侵袭的变化;细胞流式实验、Western blot检测细胞凋亡的变化;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达;AKT/mTOR通路相关蛋白的变化。结果:CCK8显示Prucalopride显著抑制U251细胞的增殖（P＜0.05）;Transwell侵袭实验显示Prucalopride可以抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭（P＜0.05）;细胞流式实验显示Prucalopride促进U251细胞的凋亡（P＜0.05）,Prucalopride处理后细胞凋亡相关蛋白Bax、Active Caspase3水平升高,Bcl-2表达降低;自噬相关蛋LC3、Beclin1表达上调,p62表达下调;p-AKT蛋白和p-mTOR蛋白水平显著降低。结论:Prucalopride通过抑制AKT/mTOR信号通路激活自噬抑制U251细胞增殖和迁移,促进其凋亡。