荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

目的利用SmartCycler系统建立一种简便、快速的荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称SAU）的方法。方法根据SAU特异nuc基因设计引物和探针,建立检测体系,并在体系中加入内质控IAC,通过另一个标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC。用SAU6538株污染饮用水和牛奶模拟实际样本,以评价体系的性能。结果以含nuc片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度为5拷贝/μl;以6538株基因组DNA为模板,最低检测限为10fg/μl;用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取DNA为模板,最低检测限为50cfu/ml。建立的定量标准曲线的循环域值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2≥0.998）,PCR效率E≥96.7%。用SAU6538污染饮用水和牛奶模拟实际样本,灵敏度可达5×102cfu/25ml样本。结论所建立的nuc-IAC荧光定量PCR具有内质控IAC,既能定量检测食物是否被污染,又能监测PCR体系,防止假阴性发生或低估病原菌污染量。     

定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的建立一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法。方法采用TaqMan荧光探针技术,针对炭疽芽孢杆菌质粒pXO1、pXO2上的基因设计引物;用炭疽芽孢杆菌（Sterne株）污染环境土壤来模拟实际样本,比较了从土壤中提取DNA的不同方法对检测效果的影响,并与同类进口试剂进行了平行比对。结果以含有检测目的片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度可达到101拷贝/μl;用Sterne株芽孢悬液污染土壤,检测灵敏度可达2.5×103cfu/g土壤。我们研制的试剂与进口试剂在敏感性和准确性方面一致,且操作简便。结论本研究建立的炭疽芽孢杆菌实时定量PCR检测方法可特异、灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌。     

基于多重PCR的呼吸道病毒纳米孔测序快速检测的方法学研究

目的 通过对多重PCR扩增条件的优化和纳米孔测序中病原微生物检测特异性及灵敏度的评价,建立一种由多重PCR和纳米孔测序技术相结合的检测技术体系,满足对呼吸道病毒现场快速检测鉴定的需求。方法 首先针对呼吸道病毒设计特异性引物,其次优化PCR扩增条件,建立快速测序体系,最后对不同浓度的病原体进行扩增与测序鉴定,评价检测体系的灵敏度。结果 优化后的多重PCR检测体系在退火温度为55℃、引物添加浓度为0.1μmol/L时,可同时检出25种呼吸道病毒,检测灵敏度可达1×10⁴拷贝/ml,整体检测时间在4 h以内。结论 该方法简单快捷,能够实时获取扩增片段的序列信息,特异性强,灵敏度较高,有望为呼吸道病原体的快速筛选和现场检测鉴定提供有力技术支撑。     

梭菌属神经毒素的基因鉴定与分型

目的:建立梭菌属神经毒素基因快速鉴定和分型的PCR方法。方法:根据GenBank提供的肉毒毒素及破伤风毒素基因序列,综合应用多种生物学软件与在线分析平台,设计特异性及通用检测引物,对各型梭菌属毒素基因进行PCR扩增,验证扩增反应的特异性、通用性、灵敏度及重复性。结果与结论:设计了针对A,B,E,F型肉毒毒素、破伤风毒素基因轻链毒性活性区的5对特异引物,以及重链跨膜区和结合区的一对通用引物(BonAB-P01/P02,BonB-P01/P02,BonE-P01/P02,BonF-P01/P02,TET-P01/P02,TY-P01/P02)。对各型神经毒素进行特异性扩增并在型间进行交叉实验,检测特异性良好,没有交叉反应;通用扩增结果显示均得到1 100 bp大小的条带。目前此检测方法灵敏度可达到(1~3)×103个菌。该检测方法特异性强,灵敏度高,可以用于梭菌属神经毒素基因的快速筛查与鉴定分型。     

实时荧光定量PCR法检测炭疽杆菌

为建立一种简便而特异的炭疽杆菌检测方法用作临床诊断工具，以nXO1持粒上的pag基因及pXO2质粒上的cap基因为靶合成特异引物，用DNA嵌入荧光染料SYBR Green I进行定量PCR扩增，在PCR后进行熔融曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，定量PCR条件优化结果为：引物浓度0．8umol/L,Mg^2 5.0mmol/L。该法检测炭疽的灵敏度达10^3拷贝，并能区分炭疽杆菌与其他蜡样杆菌，表明实时荧光定量PCR技术能够快速准确，特异地对炭疽进行定量分析。     

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证

目的 建立一种化学发光基因芯片检测方法,实现7种腹泻病毒,A组轮状病毒、B组轮状病毒、Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的快速、准确检测.方法 选择7种病毒特异性基因的保守区,设计引物与探针,制备寡核苷酸基因芯片.将多重实时荧光PCR(RT-PCR)扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光检测后进行结果分析.在优化的RT-PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,评价芯片的灵敏度、重复性和特异性.结果 研制的基因芯片具有良好的特异性和灵敏度,检测体外转录RNA参考品的最低检测限为3×103拷贝/反应,检测临床样本的灵敏度为95.2％、特异性为92.1％、符合率为95.1％.结论 建立了一种基于化学发光基因芯片的腹泻病毒检测方法,此法能快速、灵敏、特异地检测和鉴别7种腹泻病毒,具有较好的应用前景.     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

多重环介导等温扩增快速检测沙门菌、副溶血弧菌和单核细胞增生性李斯特菌方法的建立

目的：建立能够同时检测沙门菌、副溶血弧菌（VPH）和单核细胞增生性李斯特菌（LM）的多重环介导等温扩增（mLAMP）方法。方法分别针对沙门菌 bcfD 基因、VPH 的 tlh 基因和 LM的 iap 基因设计 mLAMP 引物,以LAMP 进行单重 LAMP 检测。实时浊度监测扩增结果,优化引物浓度配比,进而建立此3种食源性致病菌的mLAMP 检测体系,以 PCR 检测灵敏性作为比较,进行特异性和灵敏性分析。结果实时浊度监测表明,该 mLAMP体系具有良好特异性,可在45 min 内一次性检测以上3种致病菌,且无非特异扩增产生。这3种菌的检测最低限分别为300 fg／μl、4．2 pg／μl 和4．5 pg／μl,与 PCR 检测灵敏度相当。结论该多重 LAMP 可同时检测食品中的沙门菌、VPH 和 LM,可作为大规模样品的初筛或传统方法的辅助方法,用于快速判定样品中是否含有这3种致病菌。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

Luminex液相芯片技术检测6种虫媒病毒方法的建立

目的 建立森林脑炎病毒(TBEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、辛得比斯病毒(SINV)、西尼罗病毒(WNV)、东部马脑炎病毒(EEEV)、登革热病毒(DENV)6种虫媒病毒的液相芯片检测技术,并对该方法进行评价.方法 制备6种虫媒病毒的特异性单克隆抗体,检测抗体标记生物素,捕获抗体偶联荧光聚苯乙烯微球,建立双抗体夹心的液相芯片检测技术,利用Luminex200分析系统对6种虫媒病毒分别进行单一、多重液相芯片检测.结果 将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的2倍可对上述6种虫媒病毒进行有效鉴定.多批次实验均能对6种单一病毒样本和混合病毒样本进行准确鉴定,未出现交叉反应,批次间变异系数(CV)均小于7％,表明该方法的稳定性和特异性均较好.同时对该方法的敏感性进行鉴定,结果表明检测TBEV、WNV、JEV、SINV、EEEV、DENV的敏感性分别达到25.00、781.25、781.25、390.63、781.25、1562.5pfu/ml.该方法与ELISA相比具有灵敏性高、重复性好、节省样本和时间等优点,特异性相当.结论 通过制备特异性单克隆抗体,成功建立了可同时检测6种虫媒病毒的液相芯片检测技术平台.该平台对于病原体的检测具有较好的应用前景.     

聚合酶螺旋反应快速检测甲型H1N1流感病毒

目的 建立利用聚合酶螺旋反应(PSR)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法.方法 针对甲型H1N1流感病毒的特异性HA基因设计了6套引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果.结果与结论 从6套引物中筛选出了最佳引物,并确定最佳温度为65℃;进一步实验表明最佳引物能特异性地检测H1N1病毒,与14种其他呼吸道病原核酸无交叉反应,敏感性达到100拷贝,与PCR敏感性一致.所建立的方法简单快速、特异性强、敏感性高,适合现场和基层单位应用推广.     

基于颜色判定的DNA环介导恒温扩增法快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立基于颜色判定的DNA环介导恒温核酸扩增法（100p—mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP）快速检测金黄色葡萄球菌（SAU）技术。方法利用LAMP法针对SAU特异基因rtUC基因设计7套引物,通过对7套引物扩增效率进行比较得到最佳引物组合来快速检测SAU,采用两种结果判断方法在50min内完成反应。结果LAMP方法检测核酸的最低浓度为7．16pg／μl,灵敏度为PCR法的10倍（PCR法为71．6pg／μ1）,同时采用22种同源或相似菌种进行特异性检测,结果表明具有良好的特异性。结论LAMP方法检测过程简单,实验装置简便,反应结果肉眼可视化辨别,灵敏度高,特异性强,特别适合基层防疫与检疫部门对SAU的快速检测。     

西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测

目的 :建立敏感、特异的西部马脑炎 (westernequineencephalitis,WEE)病毒RT_PCR检测方法。方法 :首先采用逆转录法将病毒基因组RNA逆转录为cDNA ,然后以此cDNA为模板 ,进行PCR扩增。并对PCR扩增过程中的模板量、循环数、Mg2 浓度、退火温度和延伸时间等条件进行优化 ,以提高检测的特异性和敏感性。结果 :采用经优化的条件进行PCR扩增获得了约 35 0bp的单一DNA片段 ,其大小与预期的相一致 ,且可自 0 .1TCID50 的病毒液中检测出WEE病毒基因组序列。结论 :所建立的RT_PCR方法可自病毒感染的小鼠脑组织和传代细胞中检测WEE病毒的基因组RNA。     

代谢综合征相关新基因MSRG实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立测定MSRG mRNA表达量的实时荧光定量PCR检测方法,为新基因的功能研究奠定基础.方法 根据MSRG cDNA序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品,建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的灵敏性、特异性和重复性.荧光PCR检测不同浓度葡萄糖[5 6mmol/L(G5.6)、22mmol/L(G22)、33.3mmol/L(G33.3)]刺激人肝癌细胞株HepG2细胞MSRG的表达并与半定量RT-PCR方法进行比较.结果 建立了MSRG mRNA表达的实时荧光PCR检测方法.荧光PCR检测显示G33.3、G22和G5.6组HepG2细胞MSRG表达均有显著差异,半定量RT-PCR方法检测G33.3组MSRG表达显著增加,但不能检测出G22和G5.6组间有差异.结论 本实验建立的MSRG mRNA表达实时荧光PCR检测方法灵敏性、特异性和重复性较好,为MSRG功能的研究提供了一种重要手段.     

人类流感病毒多重PCR分型方法的建立

目的建立一种可以同时检测人类A型流感病毒,B型流感病毒及A型流感病毒H1,H3,H5亚型的多重RT-PCR方法。方法根据人类流感病毒的特异性基因设计并合成多对特异性引物,建立可同时扩增出人类流感病毒亚型特异性片段的多重PCR的方法。同时,对该方法的特异性和敏感性进行了评价,并利用该方法对39份疑似swineH1N1的临床标本进行检测。结果该方法可同时扩增出A型流感病毒M基因203bp,B型流感病毒M基因296bp,A型流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为362bp（H1）,112bp（H3）,188bp（H5）,494bp（swineH1）。该实验最低可检测新甲型H1N1（A/Beijing/501/2009）病毒RNA0.5TCID50。该方法的特异性实验结果显示,在多重PCR检测中未检出非特异扩增的PCR产物。同时,使用该方法从39份疑似新甲型H1N1的临床咽拭子标本中检测出新甲型H1N1阳性的标本4份（10.2%）,季节性H1N1亚型2份（5.1%）,H3N2亚型12份30.7%,本次实验结果与WHO通过实时PCR方法检测的结果一致。结论本研究建立的多重PT-PCR方法快速、敏感,特异性强,可用于人类流感病毒的分型检测。     

3种重要虫媒病毒的RT-PCR检测

目的：建立快速、敏感、特异的虫媒病毒RT-PCR检测方法。方法：采用改进的核酸制备方法，分别从感染的乳鼠脑和细胞培养上清液中提取病毒RNA，再用RT-PCR和套式PCR方法进行检测。结果：通过对肌PCR反应条件的优化，用3种虫媒病毒的特异引物均可从不同稀释度的感染小鼠脑和细胞上清中提取的病毒RNA扩增出特异的目的基因片段。甲病毒属的东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒之间，及与黄病毒属的黄热病毒均无交叉反应，表明建立的RT-PCR检测方法特异性强。套式PCR与肝PCR比较可提高检测敏感性10～10000倍。结论：建立的肝PCR和套式：PCR法可用于3种虫媒病毒的快速检测。     

环介导恒温扩增法对嗜麦芽寡养单胞菌L2型头孢菌素β内酰胺酶基因的快速检测

目的建立快速检测L2型头孢菌素β内酰胺酶的方法。方法利用DNA环介导恒温核酸扩增法（loopmediated isothermal amplificationofDNA,LAMP）针对L2型头孢菌素B内酰胺酶基因设计的5条特异性引物,通过引物特异性识别特定BlaL2基因上的7个独立区域实现耐碳青霉烯类嗜麦芽寡养单胞菌的检测。实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件下50min内完成;钙黄绿素可视化检测表明阳性结果呈绿色,与阴性结果差异显著。结果LAMP法最低检出基因的浓度为2．58pg／μl,其灵敏度为PCR法的100倍,且具有良好的特异性。结论LAMP法具有过程简单、实验装置简便、结果肉眼可辨别、灵敏度高、特异性强等特点,对非12型头孢菌素B内酰胺酶基因的结果呈阴性,适用于临床L2型头孢菌素β内酰胺酶基因的快速检测。